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lianfeng1107

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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LZ继续摸下退火温度吧,还有就是应该跑久些,看条带会不会更明了。
11楼2013-08-22 01:28:26
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biosafety

铁杆木虫 (正式写手)

啥都不用说,模版DNA有问题。
科学-哲学-神学-玄学
12楼2013-08-22 06:19:38
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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你换引物试一下,怀疑是引物降解!
13楼2013-08-22 10:49:03
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zq347597638

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感觉是楼主PCR体系不行吧  没有P出来东西  楼主做个TD-PCR试试
14楼2013-08-23 11:20:38
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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阳性对照有条带,首先你的目标反应体系与你的阳性对照体系是完全一样的吗?如果是完全一样的,可以排除你的体系有问题,而且阳性对照应该与你的实验孔是同样的PCR反应条件,如果反应条件成熟,一般情况下是不会出现阳性对照扩增出,实验孔没有扩增出的。
不知道你的模板浓度是多大的,DNA是从什么里面抽提出来的。
我们从固定组织(也就是石蜡包埋组织)中抽提DNA时,有时候会出现这种情况,脱蜡不干净,石蜡里面含有很多杂质,造成条带弥散。
如果你是抽提的质粒或是新鲜的组织样本或是微生物、植物组织,那可能是抽提的DNA质量太差,浓度太低。模板和引物的量不合适。
仅供参考,楼上的帖子中对于条带弥散的解决方法说的也很详细了,但是我们实验中往往会遇到很多特殊的情况,不清楚你的整个实验操作流程,所以不好做判断
15楼2013-08-23 13:45:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

2013年8月21日总结(8月23日第二次修订,加上序号,使文章的层次清晰,另外修正了错漏之处)
     PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

    其对策有:
  1.减少酶量(一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点,分梯度上下调一调,其他酶也差不多如此浓度,可以参考说明书);加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
(1)改用专一性更强的DNA聚合酶,或者使用两种不同的DNA聚合酶,减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时,酶量不要太大,以免出现特异性扩增。   
(2)酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油,若此操作引起酶的浓度过高,可以适当加双蒸馏水稀释。
(3)为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性,可在反应体系中加入:1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率,两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度;减少减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓 度同方向偶联进行,但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓 度,可以采用梯度递减方式,以每次0.5mol/L递减,但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前,不要大范围地变动反应体系的复性温度,要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增,则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶,也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量,要用电泳检测一下分子量和纯度,质量不好则要重新提取和纯化DNA模板;适当增加DNA模板量,减少循环次数。
9.以上措施都不行时,最后就只能重新设计引物,加强引物的专一性。
16楼2013-08-23 22:55:49
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

不好意思8月21日回答的匆忙,写错了不少东西,我的解答请以16楼的的回答为准。
17楼2013-08-23 22:57:01
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飞行鸟

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

应该是退火温度高
快乐吧
18楼2013-08-24 00:04:23
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石头雪儿

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主你这个用的是什么染料啊,好像你的PCR没看到目的条带哦,是不是引物设计不合适,或者退火温度太低,看见好多一片模糊的带
19楼2013-08-24 21:00:42
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