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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR大侠们,我的PCR结果怎么会这样：条带很宽，有些还弥散
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lianfeng1107

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
LZ继续摸下退火温度吧，还有就是应该跑久些，看条带会不会更明了。
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11楼2013-08-22 01:28:26
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biosafety

铁杆木虫 (正式写手)
啥都不用说，模版DNA有问题。
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科学-哲学-神学-玄学
12楼2013-08-22 06:19:38
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你换引物试一下,怀疑是引物降解!
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13楼2013-08-22 10:49:03
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zq347597638

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是楼主PCR体系不行吧  没有P出来东西  楼主做个TD-PCR试试
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14楼2013-08-23 11:20:38
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
阳性对照有条带，首先你的目标反应体系与你的阳性对照体系是完全一样的吗？如果是完全一样的，可以排除你的体系有问题，而且阳性对照应该与你的实验孔是同样的PCR反应条件，如果反应条件成熟，一般情况下是不会出现阳性对照扩增出，实验孔没有扩增出的。
不知道你的模板浓度是多大的，DNA是从什么里面抽提出来的。
我们从固定组织（也就是石蜡包埋组织）中抽提DNA时，有时候会出现这种情况，脱蜡不干净，石蜡里面含有很多杂质，造成条带弥散。
如果你是抽提的质粒或是新鲜的组织样本或是微生物、植物组织，那可能是抽提的DNA质量太差，浓度太低。模板和引物的量不合适。
仅供参考，楼上的帖子中对于条带弥散的解决方法说的也很详细了，但是我们实验中往往会遇到很多特殊的情况，不清楚你的整个实验操作流程，所以不好做判断
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15楼2013-08-23 13:45:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

2013年8月21日总结（8月23日第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处）
     PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

    其对策有：
  1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
（1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。   
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。
（3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度；减少减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓 度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓 度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。
9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。
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16楼2013-08-23 22:55:49
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
不好意思8月21日回答的匆忙，写错了不少东西，我的解答请以16楼的的回答为准。
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17楼2013-08-23 22:57:01
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飞行鸟

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

应该是退火温度高
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快乐吧
18楼2013-08-24 00:04:23
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石头雪儿

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主你这个用的是什么染料啊，好像你的PCR没看到目的条带哦，是不是引物设计不合适，或者退火温度太低，看见好多一片模糊的带
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19楼2013-08-24 21:00:42
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