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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 3RACE PCR条带弥散，测序结果为载体，求助
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天云之彩

新虫 (初入文坛)

[求助] 3RACE PCR条带弥散，测序结果为载体，求助 已有1人参与

最近一直在做一个植物基因的PCR，用的是takara 的3'RACE 试剂盒，但是跑了好

多次条带都是弥散，体系也调整过，温度梯度也试过，有2次稍微好点，就切下来连

接转化去测序 ，结果全是载体，看了很多帖子说做二次或者巢式的，能不能具体点

，我是一个刚做实验的菜鸟，下面是图片，目的片段大概500bp左右，老板说一定要

刻出来，目前已经没有办法了，求大神们指点

3RACE PCR条带弥散，测序结果为载体，求助
1.jpg


3RACE PCR条带弥散，测序结果为载体，求助-1
2.jpg
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1楼 2014-12-26 13:52:25
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军歌

新虫 (初入文坛)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-26 16:41:03
楼主可以这样试试，3‘RACE要比5’RACE容易，如果扩曾有弥散，很有可能是简并引物设计的事情，特异性不强，可能在PCR过程中，简并引物同时结合很多模板，如果高退火不行的话，那就试试巢式PCR，就是以你的3‘RACE产物为模板，扩增片段靠内侧再设计一对引物，实际上就是再走一次RACE。
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2楼2014-12-26 15:44:17
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随风追梦

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-26 16:41:47
仔细看试剂盒操作说明，我现在一直在做这个，感觉问题不大，还有看你第二章图最后一个泳道切胶连接然后转化测序应该问题不大，不过直接测序真说不好，是不是你连接没连接好呢？3’Race挺简单呀。
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初心不改！
3楼2014-12-26 15:50:41
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天云之彩

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风追梦 at 2014-12-26 15:50:41
仔细看试剂盒操作说明，我现在一直在做这个，感觉问题不大，还有看你第二章图最后一个泳道切胶连接然后转化测序应该问题不大，不过直接测序真说不好，是不是你连接没连接好呢？3’Race挺简单呀。

取5ul的胶回收液体跑了一下，有条带，就是测出来的blast不对，blast结果不是这个基因，这是什么情况？
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4楼2014-12-29 16:31:01
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随风追梦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天云之彩 at 2014-12-29 16:31:01
取5ul的胶回收液体跑了一下，有条带，就是测出来的blast不对，blast结果不是这个基因，这是什么情况？...

哈哈，这个再整出不过了，我用同一个引物，经过两轮PCR都扩出来4中条带了……还仅仅只是3’，我最近也郁闷着呢，如果不行你可以重新设计引物的说……多试几次可能就好了吧，我现在才克出来1/4呢，路漫漫……加油。
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初心不改！
5楼2014-12-29 20:06:31
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天云之彩

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 随风追梦 at 2014-12-29 20:06:31
哈哈，这个再整出不过了，我用同一个引物，经过两轮PCR都扩出来4中条带了……还仅仅只是3’，我最近也郁闷着呢，如果不行你可以重新设计引物的说……多试几次可能就好了吧，我现在才克出来1/4呢，路漫漫……加油。...

好的，加油
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6楼2014-12-29 21:28:10
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