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天云之彩

新虫 (初入文坛)

[求助] 3RACE PCR条带弥散,测序结果为载体,求助 已有1人参与

最近一直在做一个植物基因的PCR,用的是takara 的3'RACE 试剂盒,但是跑了好

多次条带都是弥散,体系也调整过,温度梯度也试过,有2次稍微好点,就切下来连

接转化去测序 ,结果全是载体,看了很多帖子说做二次或者巢式的,能不能具体点

,我是一个刚做实验的菜鸟,下面是图片,目的片段大概500bp左右,老板说一定要

刻出来,目前已经没有办法了,求大神们指点

3RACE PCR条带弥散,测序结果为载体,求助
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3RACE PCR条带弥散,测序结果为载体,求助-1
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军歌

新虫 (初入文坛)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-26 16:41:03
楼主可以这样试试,3‘RACE要比5’RACE容易,如果扩曾有弥散,很有可能是简并引物设计的事情,特异性不强,可能在PCR过程中,简并引物同时结合很多模板,如果高退火不行的话,那就试试巢式PCR,就是以你的3‘RACE产物为模板,扩增片段靠内侧再设计一对引物,实际上就是再走一次RACE。
2楼2014-12-26 15:44:17
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