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3RACE PCR条带弥散,测序结果为载体,求助
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天云之彩
新虫
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金币: 7
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虫号: 3250636
注册: 2014-06-03
[
求助
]
3RACE PCR条带弥散,测序结果为载体,求助
已有1人参与
最近一直在做一个植物基因的PCR,用的是takara 的3'RACE 试剂盒,但是跑了好
多次条带都是弥散,体系也调整过,温度梯度也试过,有2次稍微好点,就切下来连
接转化去测序 ,结果全是载体,看了很多帖子说做二次或者巢式的,能不能具体点
,我是一个刚做实验的菜鸟,下面是图片,目的片段大概500bp左右,老板说一定要
刻出来,目前已经没有办法了,求大神们指点
1.jpg
2.jpg
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1楼
2014-12-26 13:52:25
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军歌
新虫
(初入文坛)
应助: 0
(幼儿园)
金币: 285.5
帖子: 17
在线: 7.2小时
虫号: 404693
注册: 2007-06-17
性别: GG
专业: 生命科学
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。
2014-12-26 16:41:03
楼主可以这样试试,3‘RACE要比5’RACE容易,如果扩曾有弥散,很有可能是简并引物设计的事情,特异性不强,可能在PCR过程中,简并引物同时结合很多模板,如果高退火不行的话,那就试试巢式PCR,就是以你的3‘RACE产物为模板,扩增片段靠内侧再设计一对引物,实际上就是再走一次RACE。
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2楼
2014-12-26 15:44:17
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