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PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。已有4人参与
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各位师兄师姐，我最近一直在做PCR，想同源克隆大麦——小麦，从大麦中查找的序列，然后设计的引物，模板是小麦的cdna，一般情况下跑出来得条带是弥散的。有条带的大小也和预计的不一样，预计大小在1300bp左右，看图片上的条带都超过2000bp了。 不知道哪里出现了问题，模板前些日子刚用tubling扩了一次，都是有条带的。 第二个问题：为什么第二幅图的条带都是连续的两条？我以前用小孔（10微升体系）的胶能扩出来一条1300bp的，但是换了大孔（20微升体系）的胶（为了回收）怎么就扩不出来了呢。 我用的酶是方塔高保真酶。 体系（10微升）：酶 0.2 引物1、引物2：各0.4 buffer： 5 dntp: 0.2 水 3.6 模板： 0.1 pcr反应条件：95——3min 95 ——15s 53——15s(有条带的那张)、65——15s(以前一直没有条带弥散，所以一直升高退火温度，可是还没有。。。) 72——1min30s 72—— 5min 一共33循环。 麻烦各位老师，师兄师姐帮我看看。  1.jpg  1`.jpg |
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18761615793
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-24 23:12:09
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原因有很多啊 1 确定模板的纯度（不纯可能会有抑制PCR的东西），确定模板没有降解 2 引物的特异性太差了，或者酶的特异性太差（一般建议1300bp不使用高保真聚合酶，一般的热启动Taq酶即可） 3 buffer的质量（或者说是PCR试剂盒的质量吧）及buffer里是否有镁离子，可以适当对镁离子浓度进行优化，也可以加DMSO有助于扩增 4 你现在是没有条带扩增出来，应该降低退火温度，当你扩增出有很多杂带的情况下才应该升高退火温度 5 也可适当的减少循环次数 6 还有跑胶时候的电压问题，制胶的胶的质量 7 用水问题，水的pH值也会有影响，不能太酸 因为现在不知道问题在哪，所以在简单的原因也要考虑其中啊 希望早日找到 问题所在  |
2楼2015-03-24 09:02:51