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hc1027木虫 (正式写手)
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[求助]
【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢
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打算做cDNA-AFLP 差异表达，想请教几个问题： 1、选择性扩增的时候用33P标记的引物是为何呢？ 这个标记的引物贵吗，价格如何？ 2、内切酶一般买什么公司的比较好呢？我做真菌的，不知道用哪种内切酶比较好？ 3、因为是第一次做，身边没人做过，请问如何判断每步的效果呢？以及每步的注意事项有什么？ ①cDNA的准备 ②酶切 ③连接 ④预扩增 ⑤选择性扩增 ⑥电泳及切胶。 希望有经验的人帮忙指点，不甚感激。 [ Last edited by hc1027 on 2012-4-14 at 15:47 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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xiaoxiong520
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 欢迎多多交流经验 2012-05-08 10:46:01
hc1027: 金币+30, ★★★很有帮助, 非常感谢，很有帮助 2012-05-08 12:40:51
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 欢迎多多交流经验 2012-05-08 10:46:01
hc1027: 金币+30, ★★★很有帮助, 非常感谢，很有帮助 2012-05-08 12:40:51
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内切酶NEB的比Fermentas的好些，我们用的是Fermentas的； 每步的检测： ①cDNA的准备 ：RNA的质量很重要，是关键，合成第一链cDNA，之后合成第二链cDNA；检测反转录结果的话：取合成的第二链cDNA产物做PCR扩增内参（action，NAPDH，tubin等），琼脂糖电泳检测条带清晰 则反转录成功； ②酶切 ：酶切后琼脂糖电泳检测成弥散条带才可进行下一步的连接 ③连接 ④预扩增：酶切连接产物梯度稀释作为预扩增的模板，预扩增产物琼脂糖电泳检测成100-1000bp的弥散条带 ⑤选择性扩增预扩增产物梯度稀释作为选择性扩增的模板，选扩产物初步用琼脂糖电泳检测应条带清晰完整； 最后选扩产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色固定分析 我最近也在做cDNA-AFLP，若我提供的有帮助，希望多多交流 |
10楼2012-05-08 10:14:06
hc1027
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11楼2012-05-08 12:46:25
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12楼2012-05-08 12:48:08
xiaoxiong520
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+5, Good！ 2012-05-09 18:51:49
西瓜: MolEPI+1, 再接再厉！ 2012-05-09 18:54:43
hc1027: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-05-10 11:27:18
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（1）建议你认真看EcoRI 和 MseI的说明书，若是双酶切 要使用Tango Buffer 这个是两个酶共用的buffer 如此双酶切时才能使酶达到100%的活性； 若果酶切不彻底，是不是模板DNA用量太大了，说明书上有酶用量对应的模板DNA量；可适当延长酶切的时间； 有一点：两个酶的反应温度不同，可采用单酶切 ，先是低温要求的EcoRI 温育后，高温灭活；之后再高温要求的MseI 温育后还是要记得灭活充分；否则做连接时，连接会受影响的；这些说明书上都有，仔细阅读； 连接时，记得加ATP，他是T4 DNA Ligase必备的辅助因子； 目前，我也只做了双酶切，因为好多文献上都是双酶切，单酶切我还没尝试呢，打算尽快尝试； （2）预扩增：酶切后充分灭活后，进行连接，连接产物要做梯度稀释进行预扩增，因为模版浓度过高 会引起非特异性扩增， 稀释倍数太大 PCR产物过少，扩增信号会太弱，检测时可能检测不到； （3）选择性扩增：你的选扩条带应该还不错，条带挺多的，琼脂糖、核酸染料、电泳条件、缓冲液等可能也会影响检测结果； （4）建议，把你试验所需的药品（酶、Mix）、PCR仪等的说明书均仔细阅读，各种注意事项会对我们初学者有帮助的； 多多交流，好运！ |
13楼2012-05-09 16:47:17
xiaoxiong520
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西瓜: 金币+3, 鼓励交流！今天很活跃啊~ 2012-05-09 21:02:34
hc1027: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-15 20:25:10
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我注意到你说你的酶切不彻底，我是做花卉的，真菌我不了解啊！吴乃虎的《基因工程原理》中有关于酶切等的相关讲解； 有点很重要的是DNA或cDNA的纯度问题：核酸内切酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所用DNA模板本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS，及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核算内切酶的活性。所以cDNA的纯化很重要的。 解决办法：①增加核酸内切酶的用量； ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的一直因素被相应的稀释； ③延长酶催化的保温时间 |
14楼2012-05-09 20:55:45
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2楼2012-04-14 20:39:57
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