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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢
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hc1027

木虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-09 18:50:58
引用回帖:
10楼: Originally posted by xiaoxiong520 at 2012-05-08 10:14:06:
内切酶NEB的比Fermentas的好些，我们用的是Fermentas的；
每步的检测：
①cDNA的准备 ：RNA的质量很重要，是关键，合成第一链cDNA，之后合成第二链cDNA；检测反转录结果的话：取合成的第二链cDNA产物做PCR扩增内 ...

我也是用的fermentas的，我是做真菌的。
买的EcoRI 和 MseI （不是快酶），37度3h，65度3h
感觉酶切还是不够彻底。
请问你是怎么切的。

连接酶也是fermentas的，说明上好像是22度只要10min，我连接了1h，不知道够了没？

1%琼脂糖，预扩什么都没有，没条带没弥散。
预扩产物我没梯度稀释，直接稀释50倍做选扩，选扩2%琼脂糖电泳倒是出来很多条带，部分由弥散。
不清楚为什么预扩什么都没有，选扩是这样的效果？
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11楼2012-05-08 12:46:25
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hc1027

木虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-09 18:50:59
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12楼2012-05-08 12:48:08
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xiaoxiong520

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, Good！ 2012-05-09 18:51:49
西瓜: MolEPI+1, 再接再厉！ 2012-05-09 18:54:43
hc1027: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-05-10 11:27:18
（1）建议你认真看EcoRI 和 MseI的说明书，若是双酶切 要使用Tango Buffer 这个是两个酶共用的buffer 如此双酶切时才能使酶达到100%的活性； 若果酶切不彻底，是不是模板DNA用量太大了，说明书上有酶用量对应的模板DNA量；可适当延长酶切的时间；
    有一点：两个酶的反应温度不同，可采用单酶切 ，先是低温要求的EcoRI 温育后，高温灭活；之后再高温要求的MseI 温育后还是要记得灭活充分；否则做连接时，连接会受影响的；这些说明书上都有，仔细阅读；
      连接时，记得加ATP，他是T4 DNA Ligase必备的辅助因子；
目前，我也只做了双酶切，因为好多文献上都是双酶切，单酶切我还没尝试呢，打算尽快尝试；
（2）预扩增：酶切后充分灭活后，进行连接，连接产物要做梯度稀释进行预扩增，因为模版浓度过高 会引起非特异性扩增， 稀释倍数太大  PCR产物过少，扩增信号会太弱，检测时可能检测不到；  
（3）选择性扩增：你的选扩条带应该还不错，条带挺多的，琼脂糖、核酸染料、电泳条件、缓冲液等可能也会影响检测结果；
（4）建议，把你试验所需的药品（酶、Mix）、PCR仪等的说明书均仔细阅读，各种注意事项会对我们初学者有帮助的；
  多多交流，好运！
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13楼2012-05-09 16:47:17
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xiaoxiong520

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 鼓励交流！今天很活跃啊~ 2012-05-09 21:02:34
hc1027: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-15 20:25:10
引用回帖:
11楼: Originally posted by hc1027 at 2012-05-08 12:46:25:
我也是用的fermentas的，我是做真菌的。
买的EcoRI 和 MseI （不是快酶），37度3h，65度3h
感觉酶切还是不够彻底。
请问你是怎么切的。

连接酶也是fermentas的，说明上好像是22度只要10min，我连接了1h，不 ...

我注意到你说你的酶切不彻底，我是做花卉的，真菌我不了解啊！吴乃虎的《基因工程原理》中有关于酶切等的相关讲解；
      有点很重要的是DNA或cDNA的纯度问题：核酸内切酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所用DNA模板本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS，及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核算内切酶的活性。所以cDNA的纯化很重要的。
      解决办法：①增加核酸内切酶的用量；
        ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的一直因素被相应的稀释；
       ③延长酶催化的保温时间
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14楼2012-05-09 20:55:45
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shucanwei

木虫 (正式写手)
我做真菌的cDNA-AFLP。
用的是NEB的酶。
你还是用同位素吗？
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
15楼2012-06-12 22:17:41
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小松果2012

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xiaoxiong520 at 2012-05-08 10:14:06
内切酶NEB的比Fermentas的好些，我们用的是Fermentas的；
每步的检测：
①cDNA的准备 ：RNA的质量很重要，是关键，合成第一链cDNA，之后合成第二链cDNA；检测反转录结果的话：取合成的第二链cDNA产物做PCR扩增内参 ...

请问一下，你合成第一链cDNA，就直接用的反转录吗？用的什么酶呢？
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16楼2014-10-30 11:46:03
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