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hc1027

木虫 (正式写手)

应助: 2 (幼儿园)
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红花: 4
帖子: 903
在线: 311.3小时
虫号: 726621
注册: 2009-03-19
专业: 环境微生物学

[求助] 【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢

打算做cDNA-AFLP 差异表达，想请教几个问题：
1、选择性扩增的时候用33P标记的引物是为何呢？这个标记的引物贵吗，价格如何？
2、内切酶一般买什么公司的比较好呢？我做真菌的，不知道用哪种内切酶比较好？
3、因为是第一次做，身边没人做过，请问如何判断每步的效果呢？以及每步的注意事项有什么？
①cDNA的准备
②酶切
③连接
④预扩增
⑤选择性扩增
⑥电泳及切胶。

希望有经验的人帮忙指点，不甚感激。

[ Last edited by hc1027 on 2012-4-14 at 15:47 ]

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1楼 2012-04-14 15:46:01

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xiaoxiong520

银虫 (初入文坛)

MolEPI: 4
应助: 8 (幼儿园)
金币: 463.4
帖子: 49
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虫号: 1400961
注册: 2011-09-14
性别: MM
专业: 观赏园艺学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, Good！ 2012-05-09 18:51:49
西瓜: MolEPI+1, 再接再厉！ 2012-05-09 18:54:43
hc1027: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-05-10 11:27:18

（1）建议你认真看EcoRI 和 MseI的说明书，若是双酶切要使用Tango Buffer 这个是两个酶共用的buffer 如此双酶切时才能使酶达到100%的活性；若果酶切不彻底，是不是模板DNA用量太大了，说明书上有酶用量对应的模板DNA量；可适当延长酶切的时间；
有一点：两个酶的反应温度不同，可采用单酶切，先是低温要求的EcoRI 温育后，高温灭活；之后再高温要求的MseI 温育后还是要记得灭活充分；否则做连接时，连接会受影响的；这些说明书上都有，仔细阅读；
   连接时，记得加ATP，他是T4 DNA Ligase必备的辅助因子；
目前，我也只做了双酶切，因为好多文献上都是双酶切，单酶切我还没尝试呢，打算尽快尝试；
（2）预扩增：酶切后充分灭活后，进行连接，连接产物要做梯度稀释进行预扩增，因为模版浓度过高会引起非特异性扩增，稀释倍数太大  PCR产物过少，扩增信号会太弱，检测时可能检测不到；
（3）选择性扩增：你的选扩条带应该还不错，条带挺多的，琼脂糖、核酸染料、电泳条件、缓冲液等可能也会影响检测结果；
（4）建议，把你试验所需的药品（酶、Mix）、PCR仪等的说明书均仔细阅读，各种注意事项会对我们初学者有帮助的；
  多多交流，好运！