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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢
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xiaoxiong520

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 欢迎多多交流经验 2012-05-08 10:46:01
hc1027: 金币+30, ★★★很有帮助, 非常感谢，很有帮助 2012-05-08 12:40:51
内切酶NEB的比Fermentas的好些，我们用的是Fermentas的；
每步的检测：
①cDNA的准备 ：RNA的质量很重要，是关键，合成第一链cDNA，之后合成第二链cDNA；检测反转录结果的话：取合成的第二链cDNA产物做PCR扩增内参（action，NAPDH，tubin等），琼脂糖电泳检测条带清晰 则反转录成功；
②酶切 ：酶切后琼脂糖电泳检测成弥散条带才可进行下一步的连接
③连接
④预扩增：酶切连接产物梯度稀释作为预扩增的模板，预扩增产物琼脂糖电泳检测成100-1000bp的弥散条带
⑤选择性扩增预扩增产物梯度稀释作为选择性扩增的模板，选扩产物初步用琼脂糖电泳检测应条带清晰完整； 最后选扩产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色固定分析
我最近也在做cDNA-AFLP，若我提供的有帮助，希望多多交流
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10楼2012-05-08 10:14:06
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xiaoxiong520

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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西瓜: 金币+5, Good！ 2012-05-09 18:51:49
西瓜: MolEPI+1, 再接再厉！ 2012-05-09 18:54:43
hc1027: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-05-10 11:27:18
（1）建议你认真看EcoRI 和 MseI的说明书，若是双酶切 要使用Tango Buffer 这个是两个酶共用的buffer 如此双酶切时才能使酶达到100%的活性； 若果酶切不彻底，是不是模板DNA用量太大了，说明书上有酶用量对应的模板DNA量；可适当延长酶切的时间；
    有一点：两个酶的反应温度不同，可采用单酶切 ，先是低温要求的EcoRI 温育后，高温灭活；之后再高温要求的MseI 温育后还是要记得灭活充分；否则做连接时，连接会受影响的；这些说明书上都有，仔细阅读；
      连接时，记得加ATP，他是T4 DNA Ligase必备的辅助因子；
目前，我也只做了双酶切，因为好多文献上都是双酶切，单酶切我还没尝试呢，打算尽快尝试；
（2）预扩增：酶切后充分灭活后，进行连接，连接产物要做梯度稀释进行预扩增，因为模版浓度过高 会引起非特异性扩增， 稀释倍数太大  PCR产物过少，扩增信号会太弱，检测时可能检测不到；  
（3）选择性扩增：你的选扩条带应该还不错，条带挺多的，琼脂糖、核酸染料、电泳条件、缓冲液等可能也会影响检测结果；
（4）建议，把你试验所需的药品（酶、Mix）、PCR仪等的说明书均仔细阅读，各种注意事项会对我们初学者有帮助的；
  多多交流，好运！
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13楼2012-05-09 16:47:17
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