| 查看: 2617 | 回复: 15 | |||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
hc1027木虫 (正式写手)
|
[求助]
【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢
|
||
|
打算做cDNA-AFLP 差异表达，想请教几个问题： 1、选择性扩增的时候用33P标记的引物是为何呢？ 这个标记的引物贵吗，价格如何？ 2、内切酶一般买什么公司的比较好呢？我做真菌的，不知道用哪种内切酶比较好？ 3、因为是第一次做，身边没人做过，请问如何判断每步的效果呢？以及每步的注意事项有什么？ ①cDNA的准备 ②酶切 ③连接 ④预扩增 ⑤选择性扩增 ⑥电泳及切胶。 希望有经验的人帮忙指点，不甚感激。 [ Last edited by hc1027 on 2012-4-14 at 15:47 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有206人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有1人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请问cDNA-AFLP中酶切的问题，谢谢大家
已经有7人回复
- 鼠骨髓细胞（rat bone marrow cell）培养的一个问题，请教大家。谢谢
已经有30人回复
- 请教关于PAUP软件的界面问题，谢谢了！
已经有6人回复
- 实验分析遇到一些小问题，请教大家！
已经有5人回复
- 请教关于做热模拟压缩实验时往试样上焊接热电偶的问题
已经有19人回复
- 请教第一作者和通讯作者的相关问题，谢谢！
已经有15人回复
- 请教关于转子流量计与压强相关的问题，请大家帮帮忙，谢谢
已经有3人回复
- 请教关于拉曼光谱表面增强计算和实验问题，谢谢
已经有16人回复
- 想请教一下吸附实验中红外光谱强度的问题···谢谢
已经有10人回复
- 【求助/交流】cDNA-AFLP试验
已经有4人回复
- 【请教】做实验遇到三个不明白的问题，希望各位师兄师姐指点一二，谢谢
已经有7人回复
- 【求助/交流】请教一个简单问题：新买的载玻片需要清洗么？盖玻片呢？谢谢！
已经有18人回复
- 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
已经有12人回复
- 【求助】关于MTT实验的问题请教
已经有11人回复
xiaoxiong520
银虫 (初入文坛)
- MolEPI: 4
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 463.4
- 帖子: 49
- 在线: 19.3小时
- 虫号: 1400961
- 注册: 2011-09-14
- 性别: MM
- 专业: 观赏园艺学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 欢迎多多交流经验 2012-05-08 10:46:01
hc1027: 金币+30, ★★★很有帮助, 非常感谢，很有帮助 2012-05-08 12:40:51
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 欢迎多多交流经验 2012-05-08 10:46:01
hc1027: 金币+30, ★★★很有帮助, 非常感谢，很有帮助 2012-05-08 12:40:51
|
内切酶NEB的比Fermentas的好些，我们用的是Fermentas的； 每步的检测： ①cDNA的准备 ：RNA的质量很重要，是关键，合成第一链cDNA，之后合成第二链cDNA；检测反转录结果的话：取合成的第二链cDNA产物做PCR扩增内参（action，NAPDH，tubin等），琼脂糖电泳检测条带清晰 则反转录成功； ②酶切 ：酶切后琼脂糖电泳检测成弥散条带才可进行下一步的连接 ③连接 ④预扩增：酶切连接产物梯度稀释作为预扩增的模板，预扩增产物琼脂糖电泳检测成100-1000bp的弥散条带 ⑤选择性扩增预扩增产物梯度稀释作为选择性扩增的模板，选扩产物初步用琼脂糖电泳检测应条带清晰完整； 最后选扩产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色固定分析 我最近也在做cDNA-AFLP，若我提供的有帮助，希望多多交流 |
10楼2012-05-08 10:14:06
xiaoxiong520
银虫 (初入文坛)
- MolEPI: 4
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 463.4
- 帖子: 49
- 在线: 19.3小时
- 虫号: 1400961
- 注册: 2011-09-14
- 性别: MM
- 专业: 观赏园艺学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 鼓励交流！今天很活跃啊~ 2012-05-09 21:02:34
hc1027: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-15 20:25:10
西瓜: 金币+3, 鼓励交流！今天很活跃啊~ 2012-05-09 21:02:34
hc1027: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-15 20:25:10
|
我注意到你说你的酶切不彻底，我是做花卉的，真菌我不了解啊！吴乃虎的《基因工程原理》中有关于酶切等的相关讲解； 有点很重要的是DNA或cDNA的纯度问题：核酸内切酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所用DNA模板本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS，及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核算内切酶的活性。所以cDNA的纯化很重要的。 解决办法：①增加核酸内切酶的用量； ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的一直因素被相应的稀释； ③延长酶催化的保温时间 |
14楼2012-05-09 20:55:45
 |
2楼2012-04-14 20:39:57
|
|
3楼2012-04-15 15:51:15
foxmygod 
银虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 293.6
- 帖子: 115
- 在线: 20.2小时
- 虫号: 1683007
- 注册: 2012-03-11
- 性别: GG
- 专业: 作物种质资源与遗传育种学
4楼2012-04-22 02:28:04
hc1027
木虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1414.3
- 散金: 107
- 红花: 4
- 帖子: 903
- 在线: 311.3小时
- 虫号: 726621
- 注册: 2009-03-19
- 专业: 环境微生物学
5楼2012-04-22 09:16:43
foxmygod
银虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 293.6
- 帖子: 115
- 在线: 20.2小时
- 虫号: 1683007
- 注册: 2012-03-11
- 性别: GG
- 专业: 作物种质资源与遗传育种学
6楼2012-04-24 22:00:10
hc1027
木虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1414.3
- 散金: 107
- 红花: 4
- 帖子: 903
- 在线: 311.3小时
- 虫号: 726621
- 注册: 2009-03-19
- 专业: 环境微生物学
7楼2012-04-24 22:39:27
8楼2012-04-25 10:47:38
hc1027
木虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1414.3
- 散金: 107
- 红花: 4
- 帖子: 903
- 在线: 311.3小时
- 虫号: 726621
- 注册: 2009-03-19
- 专业: 环境微生物学
9楼2012-04-25 16:43:49
