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hc1027

木虫 (正式写手)

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[求助] 【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢

打算做cDNA-AFLP 差异表达，想请教几个问题：
1、选择性扩增的时候用33P标记的引物是为何呢？这个标记的引物贵吗，价格如何？
2、内切酶一般买什么公司的比较好呢？我做真菌的，不知道用哪种内切酶比较好？
3、因为是第一次做，身边没人做过，请问如何判断每步的效果呢？以及每步的注意事项有什么？
①cDNA的准备
②酶切
③连接
④预扩增
⑤选择性扩增
⑥电泳及切胶。

希望有经验的人帮忙指点，不甚感激。

[ Last edited by hc1027 on 2012-4-14 at 15:47 ]

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1楼 2012-04-14 15:46:01

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xiaoxiong520

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 欢迎多多交流经验 2012-05-08 10:46:01
hc1027: 金币+30, ★★★很有帮助, 非常感谢，很有帮助 2012-05-08 12:40:51

内切酶NEB的比Fermentas的好些，我们用的是Fermentas的；
每步的检测：
①cDNA的准备：RNA的质量很重要，是关键，合成第一链cDNA，之后合成第二链cDNA；检测反转录结果的话：取合成的第二链cDNA产物做PCR扩增内参（action，NAPDH，tubin等），琼脂糖电泳检测条带清晰则反转录成功；
②酶切：酶切后琼脂糖电泳检测成弥散条带才可进行下一步的连接
③连接
④预扩增：酶切连接产物梯度稀释作为预扩增的模板，预扩增产物琼脂糖电泳检测成100-1000bp的弥散条带
⑤选择性扩增预扩增产物梯度稀释作为选择性扩增的模板，选扩产物初步用琼脂糖电泳检测应条带清晰完整；最后选扩产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色固定分析
我最近也在做cDNA-AFLP，若我提供的有帮助，希望多多交流

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10楼2012-05-08 10:14:06

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xiaoxiong520

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 鼓励交流！今天很活跃啊~ 2012-05-09 21:02:34
hc1027: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-15 20:25:10

引用回帖:

11楼: Originally posted by hc1027 at 2012-05-08 12:46:25:
我也是用的fermentas的，我是做真菌的。
买的EcoRI 和 MseI （不是快酶），37度3h，65度3h
感觉酶切还是不够彻底。
请问你是怎么切的。

连接酶也是fermentas的，说明上好像是22度只要10min，我连接了1h，不 ...

我注意到你说你的酶切不彻底，我是做花卉的，真菌我不了解啊！吴乃虎的《基因工程原理》中有关于酶切等的相关讲解；
   有点很重要的是DNA或cDNA的纯度问题：核酸内切酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所用DNA模板本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS，及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核算内切酶的活性。所以cDNA的纯化很重要的。
   解决办法：①增加核酸内切酶的用量；
      ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的一直因素被相应的稀释；
   ③延长酶催化的保温时间

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14楼2012-05-09 20:55:45

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