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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:24
泰州木虫: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-07-25 09:29:31
假定你要的产物的确有表达,而且你的cDNA也没问题的话,那么考虑GC含量是一个方面。GC高的话第一是不容易扩增,第二还有可能缺失片断。如果你的聚合酶有GC enhancer的话可以加一些试一下,会有帮助的。我曾经有克隆过一个总长1.5k的片段,其中有一段GC%有百分之八九十,就很容易扩增失败或者是缺失序列。加了GC enhancer就好了。

其次就是你的酶,如果你的序列GC含量高的话,那么普通的酶是很难扩出来东西的。最好用好一些的,我个人最喜欢用的是Invitrogen的Pfx,刚才说的那个问题就是用Pfx+GC enhancer解决的。而且我后来用普通Taq酶作菌液PCR的时候就很难得到目的片段,也是由于普通Taq酶不给力的问题。再次说明酶是个比较重要的因素,尤其GC高的时候。

再次就是PCR反应了。说实话66度感觉挺高的,一般我很少会用到这么高温,不过当然也可能跟你设计引物有关。可以试着做个梯度还有就是延伸时间注意要够长。

暂时想到这么多吧。
下次再见面的时候,我们一定会笑着相遇吧
3楼2014-07-24 20:43:09
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