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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助SMART RACE ，5‘-RACE问题
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wenzi6337

木虫 (著名写手)

[求助] 求助SMART RACE ，5‘-RACE问题 已有4人参与

如题，我在做SMART RACE时首先用随机引物和通用引物合成cDNA，然后以cDNA为模板用Short2引物和CDS特异性引物扩增，切胶回收500-700bp条带，连pMD-18T载体测序，问题是，测序结果显示有片段连入，但不是我要找的CDS序列，请教各位大侠，是什么地方出了问题？为什么CDS引物扩出无关条带？是引物特异性差吗？请了解SMART RACE的大侠指点一二，不胜感激！
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1楼 2014-07-09 09:58:07
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wenzi6337(myprayer代发): 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-07-09 13:15:09
wenzi6337: 金币+5, ★有帮助 2014-07-09 13:58:09
你说对了，你的引物特异性差
RACE这个东西不好做，慢慢练吧
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2楼2014-07-09 11:30:48
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lma223

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wenzi6337: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢啊！ 2014-07-09 14:01:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-09 16:07:35
为了保障你的RACE能够特异性，请设计多条引物，有种方法叫做 Asymetric PCR with nested primer。即，先用你的specific 引物1 单引物扩增10-50个cycle，然后再用新的specific 引物2 （引物2的位置应该在引物1的上游）和5‘ 末端引物进行正常PCR扩增。  祝好！
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知行合一，致良知！
3楼2014-07-09 13:58:19
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wenzi6337

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2014-07-09 11:30:48
你说对了，你的引物特异性差
RACE这个东西不好做，慢慢练吧

引物设计需要哪些注意事项呢？引物长度多少个碱基比较合适，Tm值会影响很大吗？退火温度需要从70度开始吗？谢谢！
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4楼2014-07-09 13:59:51
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wenzi6337: 金币+2, ★有帮助 2014-07-10 00:09:47
你可能没完全理解smart，更没理解race，前面的双链都没做好，后面得引物设计也很关键，扩增目的片段需要采用合适的策略，你必须把每一样都做实了，才能OK

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-07-09 19:25:08
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zqlswu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wenzi6337: 金币+2, ★有帮助 2014-07-10 00:09:52
用第一轮PCR产物来作为模板，再进行一轮巢式PCR，可以提高特异性，不行就重设引物再试也可！祝好！

[ 发自小木虫客户端 ]
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要么忙着去死，要不忙着去活，好好地！
6楼2014-07-09 19:36:27
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gaohy555

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2014-12-18 09:39:46
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