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wenzi6337

木虫 (著名写手)

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[求助] 求助SMART RACE ，5‘-RACE问题已有4人参与

如题，我在做SMART RACE时首先用随机引物和通用引物合成cDNA，然后以cDNA为模板用Short2引物和CDS特异性引物扩增，切胶回收500-700bp条带，连pMD-18T载体测序，问题是，测序结果显示有片段连入，但不是我要找的CDS序列，请教各位大侠，是什么地方出了问题？为什么CDS引物扩出无关条带？是引物特异性差吗？请了解SMART RACE的大侠指点一二，不胜感激！

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1楼2014-07-09 09:58:07

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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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wenzi6337(myprayer代发): 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-07-09 13:15:09
wenzi6337: 金币+5, ★有帮助 2014-07-09 13:58:09

你说对了，你的引物特异性差
RACE这个东西不好做，慢慢练吧

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2楼2014-07-09 11:30:48

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lma223

铜虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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wenzi6337: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢啊！ 2014-07-09 14:01:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-09 16:07:35

为了保障你的RACE能够特异性，请设计多条引物，有种方法叫做 Asymetric PCR with nested primer。即，先用你的specific 引物1 单引物扩增10-50个cycle，然后再用新的specific 引物2 （引物2的位置应该在引物1的上游）和5‘ 末端引物进行正常PCR扩增。祝好！

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