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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 紧急求助5‘RACE（测序结果问题）
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

[求助] 紧急求助5‘RACE（测序结果问题）

鄙人最近在做5’RACE，用的是Clontech的SMARTer RACE cDNA Amlification Kit试剂盒。巢式PCR玩切胶回收，纯化测序，测序结果是这样子的：出来一个100多得片段，经过同源比对，发现这个片段比其他物种的基因片段5‘端少20左右bp，但是在测出的片段中巢式前、后特异性引物都是有的。   就想请教一下：1，巢式PCR前、后特异性引物都能找到，但是片段比同源植物的基因片段5’端小20bp，有可能是在做5‘RACE前，提取的RNA在5’末端稍有降解，导致反转录出的片段不是完整的片段？  2、有没有可能这个植物中的这个基因片段就是比其他同源植物中的该基因片段小？  
  谢谢各位大侠！！！  小弟在此谢过！！！  急-------
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勤能补拙
1楼 2012-09-14 10:02:08
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的基因5‘端测序只有200多bp，那就是你最开始设计引物的序列靠近5’端。既然你现在还缺20bp左右，你可以根据现在的两个片段拼接之后的序列，重新设计引物，再次做PCR扩增，如果没有得到更长的序列就可以考虑：你的基因片段比其他同源植物中的该基因片段小。以上纯属个人观点，仅供参考！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-09-14 10:14:22
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-14 10:14:22
你的基因5‘端测序只有200多bp，那就是你最开始设计引物的序列靠近5’端。既然你现在还缺20bp左右，你可以根据现在的两个片段拼接之后的序列，重新设计引物，再次做PCR扩增，如果没有得到更长的序列就可以考虑：你的 ...

谢谢，有没有更好的建议或看法，因为鄙人快要毕业了！
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勤能补拙
3楼2012-09-14 10:46:02
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-09-14 10:46:02
谢谢，有没有更好的建议或看法，因为鄙人快要毕业了！...

有没有你需要的物种中该基因的EST序列，有的话可以试着将5‘端拼接起来。没有那你就只能继续P，继续测序了。
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持之以恒、永不放弃！
4楼2012-09-14 11:05:27
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-14 11:05:27
有没有你需要的物种中该基因的EST序列，有的话可以试着将5‘端拼接起来。没有那你就只能继续P，继续测序了。...

没有呀！！悲剧的实验！
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勤能补拙
5楼2012-09-14 11:07:48
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wushuwei1104: 金币+3, ★有帮助 2012-09-14 11:23:40
引用回帖:
5楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-09-14 11:07:48
没有呀！！悲剧的实验！...

那你也不要灰心，顺利的话你一周就可以搞定5’端全序列。祝好运！
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持之以恒、永不放弃！
6楼2012-09-14 11:11:21
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-14 11:11:21
那你也不要灰心，顺利的话你一周就可以搞定5’端全序列。祝好运！...

谢谢哥们儿！！！
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勤能补拙
7楼2012-09-14 11:23:13
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫
你不是克隆测序？如果是克隆测序出来时这样结果：有可能是5‘有降解，不是克隆测序的话，直接产物测序那极有可能是序列读序问题了。当然每种物种也有特列，比如像你所说的是比其他物种少几十bp，但是如果这个序列在大多数物种都相对稳定的话，最终我觉得还是RNA有一点点降解，恰好5’结头连在这样的RNA上了。一定要进行克隆测序哦！
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好好学习，天天向上
8楼2012-09-17 09:44:24
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dayulee at 2012-09-17 09:44:24
你不是克隆测序？如果是克隆测序出来时这样结果：有可能是5‘有降解，不是克隆测序的话，直接产物测序那极有可能是序列读序问题了。当然每种物种也有特列，比如像你所说的是比其他物种少几十bp，但是如果这个序列在 ...

我的是PCR产物纯化测序，没有经过克隆！  谢谢您的帮忙，我也觉得可能是RNA5‘端有降解，看来又要重做了！！悲剧----   不管怎样，谢谢您！！
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勤能补拙
9楼2012-09-17 18:32:52
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫
克隆测序可以保证获得序列全长，产物直接测序开始的一部分序列是读不全或读不准确的，先克隆测序一下吧。重做5'那么麻烦
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好好学习，天天向上
10楼2012-09-18 09:17:27
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