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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 3‘RACE电泳结果
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某人zy

铜虫 (初入文坛)

[求助] 3‘RACE电泳结果

这是我跑完3'RACE inner之后的电泳图，有很多条带，不知道下一步应该怎么做了。我是新手，也不知道怎样预测目的片段的长度，是不是应该把最上面的条带切胶之后去测序呢？请各位高手指导指导。

20130414 3\'RACE2.jpg
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1楼2013-04-14 22:12:16
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我认为还是PCR扩增时的专一性较差，可以尽量提高转型扩增试试看，也就是加高镁离子浓度由1.0mmol/L逐渐调高，镁离子浓度最高不要超过10.0mmol/L，加入少量BSA，引物浓度上下调一下，退火温度我认为还可以，如果任然不奏效我认为应该重新设计模板，引物的3‘末端最好为G或C，引物至少长18个碱基，并相应调节退火温度。再有考虑热启PCR。
进行PCR时的对照组，包括还有靶的阳性对照组，以及不含有靶的阴性对照组。
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5楼2013-04-15 15:56:38
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sj082csh

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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某人zy: 金币+5, ★有帮助 2013-04-15 13:27:45
木有对照吗？？可以很其他物种比对一下，看看你现在的片段在mRNA哪个位置，这样就好判断你目的片段大小(3\'端比较好跑，一般片段不是太长，一次就能跑到头了。）建议你今后设置对照

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2楼2013-04-15 09:05:15
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sj082csh

银虫 (小有名气)
不好意思啊，还没打完字就回贴了（用手机回的，按错了哈）非特异性条带太多，建议你改一下退火温度，再跑跑看

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-04-15 09:08:51
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某人zy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-15 09:08:51
不好意思啊，还没打完字就回贴了（用手机回的，按错了哈）非特异性条带太多，建议你改一下退火温度，再跑跑看

1、对照？不是特别明白，是用什么做对照呢？
2、我是通过克出保守区的序列，以cDNA为模板做的，我那个序列有846bp，但是我想克的基因应该有1900左右，但是不知道做RACE时怎么预测目的片段长度，不是自己只设计一端的引物吗，能具体教教我怎么看的吗？
3、我设计的引物outer的退火温度要高于inner的，通过primer5的时候我这个的引物退火温度都不怎么高，都只有50多一点。
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4楼2013-04-15 13:34:55
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whiskyxy

金虫 (正式写手)
做个巢式PCR
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6楼2013-04-16 12:47:38
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sj082csh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 某人zy at 2013-04-15 13:34:55
1、对照？不是特别明白，是用什么做对照呢？
2、我是通过克出保守区的序列，以cDNA为模板做的，我那个序列有846bp，但是我想克的基因应该有1900左右，但是不知道做RACE时怎么预测目的片段长度，不是自己只设计一端 ...

1.RACE对照： RACE第二轮时，单引物对照里不加inner引物，只加NUP；另外，设置无模板对照（不加第一PCR轮产物）．
2.将现有的序列进行BLAST，可以预测自己目的片段长度。不过在RACE时会有不确定性，例如5‘RACE时，mRNA5'端易降解，如果提RNA时质量不高，RACE后电泳结果不一定和你预测片段的大小相符
3.你的引物Tm值太低了，不利于RACE。引物长度是？设计引物时GC含量的要求是？Tm值设置的范围是？
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7楼2013-04-16 13:18:55
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某人zy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-16 13:18:55
1.RACE对照： RACE第二轮时，单引物对照里不加inner引物，只加NUP；另外，设置无模板对照（不加第一PCR轮产物）．
2.将现有的序列进行BLAST，可以预测自己目的片段长度。不过在RACE时会有不确定性，例如5‘RACE时 ...

我的引物长度的22bp，设计时GC含量的范围是40%~60%，Tm设的是55-75.  我选的是得分为100的
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8楼2013-04-16 14:36:26
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某人zy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-15 15:56:38
我认为还是PCR扩增时的专一性较差，可以尽量提高转型扩增试试看，也就是加高镁离子浓度由1.0mmol/L逐渐调高，镁离子浓度最高不要超过10.0mmol/L，加入少量BSA，引物浓度上下调一下，退火温度我认为还可以，如果任然 ...

恩恩，谢谢~~
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9楼2013-04-16 14:37:58
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真行刘

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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某人zy: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-16 21:38:59
如果你认为你RACE的结果大约是2000bp的话，就可以只是把2000bp左右的条带送去测序。其他的条带可能是本基因的一些片段，或者是同一家族中的其他基因，或者是其他不相关基因的片段，这些片段一般是不用管的。想提高特异性就最好做一个巢式PCR，。
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10楼2013-04-16 16:49:32
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