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某人zy

铜虫 (初入文坛)

[求助] 3‘RACE电泳结果

这是我跑完3'RACE inner之后的电泳图,有很多条带,不知道下一步应该怎么做了。我是新手,也不知道怎样预测目的片段的长度,是不是应该把最上面的条带切胶之后去测序呢?请各位高手指导指导。

20130414 3\'RACE2.jpg
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

我认为还是PCR扩增时的专一性较差,可以尽量提高转型扩增试试看,也就是加高镁离子浓度由1.0mmol/L逐渐调高,镁离子浓度最高不要超过10.0mmol/L,加入少量BSA,引物浓度上下调一下,退火温度我认为还可以,如果任然不奏效我认为应该重新设计模板,引物的3‘末端最好为G或C,引物至少长18个碱基,并相应调节退火温度。再有考虑热启PCR。
进行PCR时的对照组,包括还有靶的阳性对照组,以及不含有靶的阴性对照组。
5楼2013-04-15 15:56:38
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普通回帖

sj082csh

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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某人zy: 金币+5, 有帮助 2013-04-15 13:27:45
木有对照吗??可以很其他物种比对一下,看看你现在的片段在mRNA哪个位置,这样就好判断你目的片段大小(3\'端比较好跑,一般片段不是太长,一次就能跑到头了。)建议你今后设置对照

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2013-04-15 09:05:15
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sj082csh

银虫 (小有名气)

不好意思啊,还没打完字就回贴了(用手机回的,按错了哈)非特异性条带太多,建议你改一下退火温度,再跑跑看

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-04-15 09:08:51
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某人zy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-15 09:08:51
不好意思啊,还没打完字就回贴了(用手机回的,按错了哈)非特异性条带太多,建议你改一下退火温度,再跑跑看

1、对照?不是特别明白,是用什么做对照呢?
2、我是通过克出保守区的序列,以cDNA为模板做的,我那个序列有846bp,但是我想克的基因应该有1900左右,但是不知道做RACE时怎么预测目的片段长度,不是自己只设计一端的引物吗,能具体教教我怎么看的吗?
3、我设计的引物outer的退火温度要高于inner的,通过primer5的时候我这个的引物退火温度都不怎么高,都只有50多一点。
4楼2013-04-15 13:34:55
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whiskyxy

金虫 (正式写手)

做个巢式PCR
6楼2013-04-16 12:47:38
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sj082csh

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 某人zy at 2013-04-15 13:34:55
1、对照?不是特别明白,是用什么做对照呢?
2、我是通过克出保守区的序列,以cDNA为模板做的,我那个序列有846bp,但是我想克的基因应该有1900左右,但是不知道做RACE时怎么预测目的片段长度,不是自己只设计一端 ...

1.RACE对照: RACE第二轮时,单引物对照里不加inner引物,只加NUP;另外,设置无模板对照(不加第一PCR轮产物).
2.将现有的序列进行BLAST,可以预测自己目的片段长度。不过在RACE时会有不确定性,例如5‘RACE时,mRNA5'端易降解,如果提RNA时质量不高,RACE后电泳结果不一定和你预测片段的大小相符
3.你的引物Tm值太低了,不利于RACE。引物长度是?设计引物时GC含量的要求是?Tm值设置的范围是?
7楼2013-04-16 13:18:55
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某人zy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-16 13:18:55
1.RACE对照: RACE第二轮时,单引物对照里不加inner引物,只加NUP;另外,设置无模板对照(不加第一PCR轮产物).
2.将现有的序列进行BLAST,可以预测自己目的片段长度。不过在RACE时会有不确定性,例如5‘RACE时 ...

我的引物长度的22bp,设计时GC含量的范围是40%~60%,Tm设的是55-75.  我选的是得分为100的
8楼2013-04-16 14:36:26
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某人zy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-15 15:56:38
我认为还是PCR扩增时的专一性较差,可以尽量提高转型扩增试试看,也就是加高镁离子浓度由1.0mmol/L逐渐调高,镁离子浓度最高不要超过10.0mmol/L,加入少量BSA,引物浓度上下调一下,退火温度我认为还可以,如果任然 ...

恩恩,谢谢~~
9楼2013-04-16 14:37:58
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真行刘

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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某人zy: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-16 21:38:59
如果你认为你RACE的结果大约是2000bp的话,就可以只是把2000bp左右的条带送去测序。其他的条带可能是本基因的一些片段,或者是同一家族中的其他基因,或者是其他不相关基因的片段,这些片段一般是不用管的。想提高特异性就最好做一个巢式PCR,。
10楼2013-04-16 16:49:32
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