应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 3‘RACE电泳结果
111/2返回列表12下一页
查看: 2120  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

某人zy

铜虫 (初入文坛)

[求助] 3‘RACE电泳结果

这是我跑完3'RACE inner之后的电泳图，有很多条带，不知道下一步应该怎么做了。我是新手，也不知道怎样预测目的片段的长度，是不是应该把最上面的条带切胶之后去测序呢？请各位高手指导指导。

20130414 3\'RACE2.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-04-14 22:12:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我认为还是PCR扩增时的专一性较差，可以尽量提高转型扩增试试看，也就是加高镁离子浓度由1.0mmol/L逐渐调高，镁离子浓度最高不要超过10.0mmol/L，加入少量BSA，引物浓度上下调一下，退火温度我认为还可以，如果任然不奏效我认为应该重新设计模板，引物的3‘末端最好为G或C，引物至少长18个碱基，并相应调节退火温度。再有考虑热启PCR。
进行PCR时的对照组，包括还有靶的阳性对照组，以及不含有靶的阴性对照组。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2013-04-15 15:56:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

sj082csh

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
某人zy: 金币+5, ★有帮助 2013-04-15 13:27:45
木有对照吗？？可以很其他物种比对一下，看看你现在的片段在mRNA哪个位置，这样就好判断你目的片段大小(3\'端比较好跑，一般片段不是太长，一次就能跑到头了。）建议你今后设置对照

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
2楼2013-04-15 09:05:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sj082csh

银虫 (小有名气)
不好意思啊，还没打完字就回贴了（用手机回的，按错了哈）非特异性条带太多，建议你改一下退火温度，再跑跑看

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
3楼2013-04-15 09:08:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

某人zy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-15 09:08:51
不好意思啊，还没打完字就回贴了（用手机回的，按错了哈）非特异性条带太多，建议你改一下退火温度，再跑跑看

1、对照？不是特别明白，是用什么做对照呢？
2、我是通过克出保守区的序列，以cDNA为模板做的，我那个序列有846bp，但是我想克的基因应该有1900左右，但是不知道做RACE时怎么预测目的片段长度，不是自己只设计一端的引物吗，能具体教教我怎么看的吗？
3、我设计的引物outer的退火温度要高于inner的，通过primer5的时候我这个的引物退火温度都不怎么高，都只有50多一点。
赞一下 回复此楼
4楼2013-04-15 13:34:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

whiskyxy

金虫 (正式写手)
做个巢式PCR
回复此楼
6楼2013-04-16 12:47:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sj082csh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 某人zy at 2013-04-15 13:34:55
1、对照？不是特别明白，是用什么做对照呢？
2、我是通过克出保守区的序列，以cDNA为模板做的，我那个序列有846bp，但是我想克的基因应该有1900左右，但是不知道做RACE时怎么预测目的片段长度，不是自己只设计一端 ...

1.RACE对照： RACE第二轮时，单引物对照里不加inner引物，只加NUP；另外，设置无模板对照（不加第一PCR轮产物）．
2.将现有的序列进行BLAST，可以预测自己目的片段长度。不过在RACE时会有不确定性，例如5‘RACE时，mRNA5'端易降解，如果提RNA时质量不高，RACE后电泳结果不一定和你预测片段的大小相符
3.你的引物Tm值太低了，不利于RACE。引物长度是？设计引物时GC含量的要求是？Tm值设置的范围是？
赞一下 回复此楼
7楼2013-04-16 13:18:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

某人zy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-16 13:18:55
1.RACE对照： RACE第二轮时，单引物对照里不加inner引物，只加NUP；另外，设置无模板对照（不加第一PCR轮产物）．
2.将现有的序列进行BLAST，可以预测自己目的片段长度。不过在RACE时会有不确定性，例如5‘RACE时 ...

我的引物长度的22bp，设计时GC含量的范围是40%~60%，Tm设的是55-75.  我选的是得分为100的
赞一下 回复此楼
8楼2013-04-16 14:36:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

某人zy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-15 15:56:38
我认为还是PCR扩增时的专一性较差，可以尽量提高转型扩增试试看，也就是加高镁离子浓度由1.0mmol/L逐渐调高，镁离子浓度最高不要超过10.0mmol/L，加入少量BSA，引物浓度上下调一下，退火温度我认为还可以，如果任然 ...

恩恩，谢谢~~
回复此楼
9楼2013-04-16 14:37:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

真行刘

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
某人zy: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-16 21:38:59
如果你认为你RACE的结果大约是2000bp的话，就可以只是把2000bp左右的条带送去测序。其他的条带可能是本基因的一些片段，或者是同一家族中的其他基因，或者是其他不相关基因的片段，这些片段一般是不用管的。想提高特异性就最好做一个巢式PCR，。
赞一下 回复此楼
10楼2013-04-16 16:49:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 某人zy 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 厉娜 +3 张丹枫1991 2026-11-09 3/150 2026-11-09 14:58 by 天下第一剑
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考研] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 15/750 2026-11-09 13:19 by Equinoxhua
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 14/700 2026-11-09 11:52 by GwrQVVR6Oenx
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 16/800 2026-11-09 11:47 by GwrQVVR6Oenx
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 15/750 2026-11-09 11:41 by GwrQVVR6Oenx
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 10/500 2026-11-09 08:00 by IhnEQauGmT3K
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 12/600 2026-11-09 06:32 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-09 00:14 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 23:01 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 9/450 2026-11-08 22:46 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭