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匿名

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ben1147

木虫 (正式写手)

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就把编码链(ATG。。。。。AAAAAAAAA)序列丢到PP5里面,按正常设计PCR引物设计那样,单独设计forward和reverse两条引物就行了。因为两条引物扩增的片段可以没有重叠部分,所以不能,也不用按pair设计,分开单独搞就行。

真要算计mRNA到cDNA要互补,cDNA到引物要互补什么的会算疯的,除非你脑子足够清楚。

原则和设计普通PCR引物的差不多,没什么特殊的。设计完之后和UPM比较一下,不要过于容易形成cross-dimer。预测的产物片段不要太短,不然很容易把引物二聚体的条带切下来当产物做克隆,而实际上压根就没P出来。
2楼2010-10-11 15:58:44
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ben1147

木虫 (正式写手)

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另外说一点,我当初设计引物的时候,PP5里面显示的Tm都在70度以上,但是公司送来的单子上都是在65度左右。毕竟Tm都是个理论计算值,算法不一样,结果就不一样,也很正常,就没有细想,就照以往做的按PP5的为准,用了protocol里推荐的Touch-down(或者Step-down),但是没有结果。后来只好做梯度,60度退火才有产物。所以确定Ta可能还不是很容易。
3楼2010-10-11 16:08:31
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匿名

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4楼2010-10-11 16:10:42
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ben1147

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by NXYLGL2008 at 2010-10-11 16:10:42:

那如果仅仅只设计5’RACE的特异引物呢?

那就只设计reverse的
5楼2010-10-11 16:24:05
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匿名

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6楼2010-10-11 16:35:44
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