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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RACE引物设计
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匿名

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1楼 2010-10-11 15:32:26
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ben1147

木虫 (正式写手)
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就把编码链（ATG。。。。。AAAAAAAAA）序列丢到PP5里面，按正常设计PCR引物设计那样，单独设计forward和reverse两条引物就行了。因为两条引物扩增的片段可以没有重叠部分，所以不能，也不用按pair设计，分开单独搞就行。

真要算计mRNA到cDNA要互补，cDNA到引物要互补什么的会算疯的，除非你脑子足够清楚。

原则和设计普通PCR引物的差不多，没什么特殊的。设计完之后和UPM比较一下，不要过于容易形成cross-dimer。预测的产物片段不要太短，不然很容易把引物二聚体的条带切下来当产物做克隆，而实际上压根就没P出来。
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2楼2010-10-11 15:58:44
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ben1147

木虫 (正式写手)
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另外说一点，我当初设计引物的时候，PP5里面显示的Tm都在70度以上，但是公司送来的单子上都是在65度左右。毕竟Tm都是个理论计算值，算法不一样，结果就不一样，也很正常，就没有细想，就照以往做的按PP5的为准，用了protocol里推荐的Touch-down（或者Step-down），但是没有结果。后来只好做梯度，60度退火才有产物。所以确定Ta可能还不是很容易。
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3楼2010-10-11 16:08:31
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匿名

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4楼2010-10-11 16:10:42
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ben1147

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by NXYLGL2008 at 2010-10-11 16:10:42:

那如果仅仅只设计5’RACE的特异引物呢？

那就只设计reverse的
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5楼2010-10-11 16:24:05
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匿名

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6楼2010-10-11 16:35:44
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