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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PT-PCR
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godloveplum

金虫 (小有名气)

[求助] PT-PCR 已有3人参与

我提取rna后，反转录时没有加RNA酶抑制剂和DTT，最后得到的cDNA浓度为1200多，OD值也在1.8左右，本以为这个模板是可用了，但是我在用引物PCR后，跑胶后连内参都没有条带，我一共有40个基因。第二天我又，重新选了8个基因来做，结果内参又有条带了，还是同样的模板。以前这40个基因中大多数都是P出过条带来的，但是之后就一直很难p出来了，不知道是怎么回事？老板说是我加样有问题，可是我加样已经很小心了，每次加完后都有检查，从宏观上来看，该加的都已经加了，可是为什么就一直出不来条带呢？这和加样的速度有关系吗？我加样有点慢。另外，CDNA的浓度是不是过高了呀，在网上看到有人说CDNA的浓度应该很低。可是我之前做过半定量PCR，CDNA的浓度大概在六七百左右，这样我要跑至少35个循环才有条带，在40个循环时条带才比较明显，所以这次我觉得CDNA的浓度应该比较合适，应该会有比较理想的结果，可是我pcr跑胶后，结果是很令人沮丧的，求给位专家指点呐，PCR已经困扰我好久了，我都已经研二了，时间也不多了，实验一点进展都没有，很是着急呀，请各位专家不吝赐教！非常感谢！
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
1楼 2014-01-11 13:29:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
逆转录后的cDNA只有单链，反应体系里还有大量的RNA和dNTP,无法直接精确浓度，通常cDNA模板的浓度是根据逆转录时的RNA用量来推测的。不清楚你的cDNA浓度是怎么得来的。
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2楼2014-01-11 17:19:59
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测cDNA的方法我没找到过，我们都是把RNA的量固定了，用oligo dT反转充分来确保。建议你看看你的RNA降解没，再一个是不是你反转过程中有污染造成降解。
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hehe
3楼2014-01-11 19:40:05
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-11 17:19:59
逆转录后的cDNA只有单链，反应体系里还有大量的RNA和dNTP,无法直接精确浓度，通常cDNA模板的浓度是根据逆转录时的RNA用量来推测的。不清楚你的cDNA浓度是怎么得来的。

cDNA的浓度我是直接测吸光度得来的，我的RNA浓度很低，只有几ng，RNA的吸光度一个是2.35，另一个是2.10左右吧，我测RNA浓度时，发现RNA溶解不均匀，同样的样品，在一个离心管里面的，测的结果差异很大，不管是浓度还是吸光值，不知道为什么，就是底部的浓度比上层的要大，测出来溶液上层根本就没有RNA,难道RNA很溶液沉淀？
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
4楼2014-01-12 10:43:28
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-11 19:40:05
测cDNA的方法我没找到过，我们都是把RNA的量固定了，用oligo dT反转充分来确保。建议你看看你的RNA降解没，再一个是不是你反转过程中有污染造成降解。

我反转过程没有加酶抑制剂和DTT，我的cDNA浓度是直接测的吸光度，另外怎样根据RNA的浓度来推测才cDNA的浓度呢？
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
5楼2014-01-12 10:45:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by godloveplum at 2014-01-12 10:43:28
cDNA的浓度我是直接测吸光度得来的，我的RNA浓度很低，只有几ng，RNA的吸光度一个是2.35，另一个是2.10左右吧，我测RNA浓度时，发现RNA溶解不均匀，同样的样品，在一个离心管里面的，测的结果差异很大，不管是浓度 ...

不知道你是用什么方法提取的RNA，如果有沉淀步骤，需溶解均匀后侧浓度。你的RNA浓度为什么很低？用的是mRNA?
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6楼2014-01-12 11:10:22
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qinglanzhang

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你测RNA浓度的时候RNA溶解均匀了吗？反转时一般要加2微克左右总RNA，如果是吸取上层地浓度很低的溶液，估计反转效果也未必好。建议你在检测一下你的RNA质量和浓度，没有问题的话重新反转。而且，cDNA保存不当也是会降解的，特别是当溶液中杂质比较多的时候。
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7楼2014-01-13 22:10:44
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-12 11:10:22
不知道你是用什么方法提取的RNA，如果有沉淀步骤，需溶解均匀后侧浓度。你的RNA浓度为什么很低？用的是mRNA?...

我是用trizol提取的，有沉淀，我还是用60℃左右的热水溶解的，溶解后我用枪头吹吸怕打了差不多快一分钟了，然后就去测吸光值了，结果发现溶解不均匀，不知道为什么？
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
8楼2014-01-14 10:33:56
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by qinglanzhang at 2014-01-13 22:10:44
你测RNA浓度的时候RNA溶解均匀了吗？反转时一般要加2微克左右总RNA，如果是吸取上层地浓度很低的溶液，估计反转效果也未必好。建议你在检测一下你的RNA质量和浓度，没有问题的话重新反转。而且，cDNA保存不当也是会 ...

我的RNA一次全反转了，因为我们实验室不允许保留RNA，提取之后必须立即反转，我的cDNA以一次PCR时也不是40对引物都没有条带，只是大多数没有，只有几对引物P出来了，第二次也是，可是在以前做的实验是大多数引物都P出来了，哎，不知道为什么？
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
9楼2014-01-14 10:38:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by godloveplum at 2014-01-14 10:33:56
我是用trizol提取的，有沉淀，我还是用60℃左右的热水溶解的，溶解后我用枪头吹吸怕打了差不多快一分钟了，然后就去测吸光值了，结果发现溶解不均匀，不知道为什么？...

可能是浓度比较大，需要多溶解一会。测浓度和吸取样品前要混匀。
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10楼2014-01-14 14:18:20
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