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lu12306

新虫 (初入文坛)

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[求助] 以cDNA为模板扩增的目的基因发现有内含子？

以cDNA为模板扩增的目的基因，有几个问题请教一下大家：
问题：1.发现有内含子，目的基因比预期的大了600bp。这是可变剪接的原因？
2.一开始以为与没消化DNA有关，但是前段时间做了以DNA为模板扩增该目的基因，进行测序。发现以cDNA为模板的测序结果和以DNA为模板的测序结果相似性很低（NCBI Blast），并且两者的内含子也不一样（在cDNA上的内含子有的是在DNA上的阅读框里）。我觉得应该不是与没消化DNA有关吧。你们觉得呢？
3.TA克隆测序结果中找不到正向引物序列。生工说是用载体上的通用引物测序的，并且我的引物是特异性的，按理说可以找到正向引物序列呀。这是为什么？

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1楼 2015-03-04 09:16:37

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chiangscn

银虫 (正式写手)

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专业: 植物生理与生化

1. 任何一个时刻，提取的RNA里有尚未完全加工成熟的mRNA.
2. 不管是否去除gDNA污染，都无法改变事实。只有靠marker去寻找正确长度的片段克隆，才能有可能得到不含内含子的基因片段。
3. 注意灯下黑，如果测序引物位点离正向引物太短，正向引物可能不完整或有模糊碱基。
鄙视放羊的导师，学生跑到这里来问问题，如果他人不回答，咋办？干等？瞎摸索？

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wholaughslastlaughsbest

2楼2015-03-06 21:34:28

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