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lu12306

新虫 (初入文坛)

[求助] 以cDNA为模板扩增的目的基因发现有内含子?

以cDNA为模板扩增的目的基因,有几个问题请教一下大家:
问题:1.发现有内含子,目的基因比预期的大了600bp。这是可变剪接的原因?
           2.一开始以为与没消化DNA有关,但是前段时间做了以DNA为模板扩增该目的基因,进行测序。发现以cDNA为模板的测序结果和以DNA为模板的测序结果相似性很低(NCBI Blast),并且两者的内含子也不一样(在cDNA上的内含子有的是在DNA上的阅读框里)。我觉得应该不是与没消化DNA有关吧。你们觉得呢?
          3.TA克隆测序结果中找不到正向引物序列。生工说是用载体上的通用引物测序的,并且我的引物是特异性的,按理说可以找到正向引物序列呀。这是为什么?
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chiangscn

银虫 (正式写手)

1. 任何一个时刻,提取的RNA里有尚未完全加工成熟的mRNA.
2. 不管是否去除gDNA污染,都无法改变事实。只有靠marker去寻找正确长度的片段克隆,才能有可能得到不含内含子的基因片段。
3. 注意灯下黑,如果测序引物位点离正向引物太短,正向引物可能不完整或有模糊碱基。
鄙视放羊的导师,学生跑到这里来问问题,如果他人不回答,咋办?干等?瞎摸索?
wholaughslastlaughsbest
2楼2015-03-06 21:34:28
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