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为什么用cDNA做模板的PCR感觉很不稳定啊已有2人参与
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最近在拉一个基因的CDs部分，不知道是什么原因，用梯度PCR优化退火温度，根据梯度PCR结果设定的温度，就木有带的情况。两次所用的PCR条件是完全一致的。 我这是用oligo(dT) 引物反转录的cDNA模板，换了好多引物都出现类似的结果。 基因的GC搞会不会出现这样的情况？ 还是说是模板的原因？ 总共就1kb多的基因CDs，扩不出来真是说不过去啊。 哪位有经验的还望指点一下  gel.jpg |
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5楼2014-07-25 09:34:03
wei8020
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2楼2014-07-24 20:31:50
【答案】应助回帖
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myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:24
泰州木虫: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-07-25 09:29:31
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假定你要的产物的确有表达，而且你的cDNA也没问题的话，那么考虑GC含量是一个方面。GC高的话第一是不容易扩增，第二还有可能缺失片断。如果你的聚合酶有GC enhancer的话可以加一些试一下，会有帮助的。我曾经有克隆过一个总长1.5k的片段，其中有一段GC%有百分之八九十，就很容易扩增失败或者是缺失序列。加了GC enhancer就好了。 其次就是你的酶，如果你的序列GC含量高的话，那么普通的酶是很难扩出来东西的。最好用好一些的，我个人最喜欢用的是Invitrogen的Pfx，刚才说的那个问题就是用Pfx+GC enhancer解决的。而且我后来用普通Taq酶作菌液PCR的时候就很难得到目的片段，也是由于普通Taq酶不给力的问题。再次说明酶是个比较重要的因素，尤其GC高的时候。 再次就是PCR反应了。说实话66度感觉挺高的，一般我很少会用到这么高温，不过当然也可能跟你设计引物有关。可以试着做个梯度还有就是延伸时间注意要够长。 暂时想到这么多吧。 |
3楼2014-07-24 20:43:09
4楼2014-07-25 09:29:34