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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急！PAGE胶回收后做二次PCR，目的条带变得很小！愁！
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fengfeng_pp

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急！PAGE胶回收后做二次PCR，目的条带变得很小！愁！ 已有1人参与

各位大神，我从PAGE胶上按标准步骤回收差异片段，位置在1000bp-100bp 都有，用回收结果进行二次PCR之后发现：目的条带基本上都在250bp左右啊，基本上没扩出理想的目的条带（二次PCR后目的条带变小了），请问是什么原因。谢谢。
  PCR条件尝试过：提高退火温度、增加退火时间、增加延伸时间、减少引物用量、加大模板量。结果无明显改变，请各位大神赐教！

123.png



[ Last edited by fengfeng_pp on 2012-12-28 at 11:20 ]
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1楼 2012-12-28 11:17:23
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你要的片段大小是多少呢？我想你自己应该知道吧，你好多PCR条件都摸过了的话，那可能是引物的问题，特异性不够好吧。个人意见仅供参考。
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2楼2012-12-28 16:54:02
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)

夜未眠

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物特异性不强，重设设计引物试试
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世界上只有一种真正的英雄主义，那就是看清生活的真相之后，依然热爱生活。
3楼2012-12-29 09:11:49
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为请教而来

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你这个是用琼脂糖跑的吧，你再用PAGE跑一下看看和原来是否一样。
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4楼2013-03-11 09:12:33
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fengfeng_pp

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hlwnxfd2011 at 2012-12-28 16:54:02
你要的片段大小是多少呢？我想你自己应该知道吧，你好多PCR条件都摸过了的话，那可能是引物的问题，特异性不够好吧。个人意见仅供参考。

片段是应该750bp左右的，但现在只有250bp，引物也是用的别人的引物，实验证明还是不错的。
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5楼2013-03-11 10:10:18
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fengfeng_pp

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 为请教而来 at 2013-03-11 09:12:33
你这个是用琼脂糖跑的吧，你再用PAGE跑一下看看和原来是否一样。

这个肯定是琼脂糖凝胶，就算是用PAGE跑的话，现在看到的250bp片段 也不可能跑到750bp 的 位置。
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6楼2013-03-11 10:11:29
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加油小小帅

禁虫
本帖内容被屏蔽
7楼2021-02-02 14:45:52
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