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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化有菌落，挑菌转板扩大培养之后，菌落PCR没有条带
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swach

铁虫 (小有名气)

[求助] 转化有菌落，挑菌转板扩大培养之后，菌落PCR没有条带已有2人参与

转化之后有单菌落，挑单菌落到另一个板子上扩大培养，今天挑菌破壁之后，做菌落PCR，没有目的条带，全部是拖带。转化之后的板子上面单菌落有蓝白斑出现，不知道问题出在哪里？转化之后的单菌落长得很好，以为能成功的，同学最近也遇到了同样的问题。难道是转化之后的那些单菌落全都是氨苄失效长出来的杂菌吗？还是其实都是空载，只是蓝斑没有筛选出来。大前天倒得板子，在工作台里面放了两天，昨天转板，今天早上板子上出了转化的菌落，还出现了单菌落。是氨苄失效了吗？真的很急，希望大家给予意见！我的氨苄是七月四号配的，不会失效吧？
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1楼2014-07-25 19:19:47
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 22:02:51
你的amp配制之后是放在哪儿？如果是室温有失效的危险，如果是-20度冰箱是没问题的，冰箱里可以放很久。至于你倒的板子，应该是放在4度冰箱里靠谱一些。

第一次单菌落蓝白斑出现后，可以直接就用白斑做菌落PCR的，没有必要挑担菌落到另一个板子上扩大培养。你挑得单菌落扩大培养出来的菌落和你挑得是同源，不管你从扩大培养的上面pcr多少个单菌落，都和pcr前面你挑的那个单菌落一样。假使你挑出来扩大培养的那个单菌落是假阳性的话，那么你后来再怎么做pcr也得不出目的条带的。

你说‘出现了单菌落’是指菌落很密集，但菌落很少么？如果满板子都是菌落，那么假阳性的可能性很大。如果你之前转化的菌液有存在4度冰箱，可以拿出少量来再涂板，蓝白斑筛选。试着减少涂板的菌液量，让板子菌落数减少，这样可以更容易挑担菌落。蓝白斑筛选后，直接挑一二十个做菌落pcr就好

最后就是，你的pcr用的引物可信么？是通用引物的话，可以同时挑蓝斑pcr作对照。如果不是的话，优化你的pcr方案，保证你的引物是工作正常的，
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-07-25 20:03:47
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
swach(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:01:10
1.氨苄在现在这个温度下放两天够呛啊。平板倒好了在超净台放半个小时凝固了平板口一封直接放4度了，怎么能在外面一直放，你配的那个氨苄是咋保存的啊，是不是分装了放-20度？
2.LZ你这个实验是怎么做的，你是在转化后涂布在平板上，长出来的转化子挑白斑在另一个板子上扎了个氨苄母板，之后用母版上的菌做的菌落PCR没条带，还拖尾？
你现在的问题是，菌落PCR的可靠性，氨苄的可靠性，和蓝白斑的阳性率。氨苄的可靠性最重要。
如果想彻底筛查的话，你最好先做个质粒快提，先看看你母版上的转化子有没有质粒，如果你的转化子连质粒都没有的话，氨苄重配，实验重来。一旦有质粒的话，如果你连的基因本身就很大直接大小就可以判断是否空载来，如果全是空载，那你就筛查一下第一步蓝白斑筛选，按理说肯定有假阳性，但是如果全是假阳性也是很不正常的，你的蓝白斑比例是多大啊？至于你的菌落PCR如果刚开始接触的话最好阳性对照和阴性对照都加上，再重复几次不要有大量拖带才行.
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大家相互帮助哈
3楼2014-07-25 22:53:42
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-25 22:53:42
1.氨苄在现在这个温度下放两天够呛啊。平板倒好了在超净台放半个小时凝固了平板口一封直接放4度了，怎么能在外面一直放，你配的那个氨苄是咋保存的啊，是不是分装了放-20度？
2.LZ你这个实验是怎么做的，你是在转化 ...

氨苄没有分装，但每次配的都不多，只配2毫升，存放在-20度冰箱里面。氨苄配的时候，没有过滤除菌。这应该没有影响吧？
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4楼2014-07-26 13:18:50
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 20:03:47
你的amp配制之后是放在哪儿？如果是室温有失效的危险，如果是-20度冰箱是没问题的，冰箱里可以放很久。至于你倒的板子，应该是放在4度冰箱里靠谱一些。

第一次单菌落蓝白斑出现后，可以直接就用白斑做菌落PCR的， ...

氨苄是放在-20度保存，但上次做完实验之后忘记放回冰箱里面了，大概在工作台里面放了有大半个小时，不知道会不会就失效了。菌落不是很密集，还是可以挑菌的，但周围一些很小（像针眼大小）的菌落，不知道是不是氨苄的问题
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5楼2014-07-26 13:28:52
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by swach at 2014-07-26 13:18:50
氨苄没有分装，但每次配的都不多，只配2毫升，存放在-20度冰箱里面。氨苄配的时候，没有过滤除菌。这应该没有影响吧？...

我实验室都是过滤的，不过其他实验室有不过滤的用着也没问题。
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大家相互帮助哈
6楼2014-07-26 13:51:14
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 20:03:47
你的amp配制之后是放在哪儿？如果是室温有失效的危险，如果是-20度冰箱是没问题的，冰箱里可以放很久。至于你倒的板子，应该是放在4度冰箱里靠谱一些。

第一次单菌落蓝白斑出现后，可以直接就用白斑做菌落PCR的， ...

扩大培养是为了酶切之后挑菌做穿刺管送样出去测序准备，如果直接挑单菌落的话，就没有菌落剩下。我的板子长得不算密集，菌落大小还可以，表象上看和我之前做成功的板子长得差不多，所以没想到菌落pcr会出现问题。如果是空载体的话，应该是蓝斑才对吧？真的不知道问题出自哪儿了？如果是杂菌的话，转在新倒得板子上应该不长吧。
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7楼2014-07-27 10:13:05
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