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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带淡，怎样优化？（如图）
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tianti_121

新虫 (小有名气)

[求助] PCR条带淡，怎样优化？（如图） 已有12人参与

菌液PCR，反应体系：菌液0.5，引物各1，Fastpfu buffer 5，dNTP 2.5，Fastpfu酶 0.5，ddH2O 14.5，共25微升。

PCR程序：94℃ 4min，
                 94℃ 30s
                 62℃ 30s
                 72℃ 2min
                 35个循环
                 72℃  10min

目的基因大概1300多bp.

求优化条件！十分感谢！

PCR条带淡，怎样优化？（如图）
高保真菌液PCR.jpg
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1楼 2014-12-28 11:18:35
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

张解放88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:32
看了几个回复感觉很温馨。你的图片我一看，很明显模板（菌液）加入过多，看看加样孔亮度；第二，退火温度过高（没看到你的引物，所有不太好判断），可适当减到58-60℃；第三，Fastpfu酶本身针对性强，产量低，所以建议你做50ul PCR体系。多摸索，经验很重要。
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15楼2014-12-29 19:36:14
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
tianti_121: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-12-30 09:38:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by tianti_121 at 2014-12-28 13:24:43
我用普通TAQ酶62度P的很好，但换了高保真酶就出不来了...

高保真酶条件更苛刻，速度更慢，效率也略低，看你延伸时间够长，还是优化下退火温度，应该会有帮助。另外，你这种情况，增加下循环数试试，说不定也能帮助提高浓度。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2014-12-28 14:29:51
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
tianti_121(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:40
一般退火温度设置为上下引物平均值减去5℃，在这个Tm值之间进行波动，可以将退火温度设置为60℃试一下
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
12楼2014-12-29 08:23:43
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lianwenli91

新虫 (初入文坛)
其实你的模板浓度低，可以加1微升，也可以做个降落PCR。
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14楼2014-12-29 16:56:34
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普通回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-28 23:05:11
优化下退火温度吧，一般不会那么高。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-12-28 12:03:51
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tianti_121

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-28 12:03:51
优化下退火温度吧，一般不会那么高。

合成的引物上游退火温度62.67，下游67.75。请问设计多少合适？
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3楼2014-12-28 12:19:31
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:51
额，那个不准的，一般常用是54-56，极端情况可以更高或更低。我一般前用54度试试，不行就做退火温度梯度。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-12-28 12:30:47
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tianti_121

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-28 12:30:47
额，那个不准的，一般常用是54-56，极端情况可以更高或更低。我一般前用54度试试，不行就做退火温度梯度。

我用普通TAQ酶62度P的很好，但换了高保真酶就出不来了
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5楼2014-12-28 13:24:43
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aotoulan

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-28 23:05:54
本帖内容被屏蔽
6楼2014-12-28 13:48:18
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tianti_121

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aotoulan at 2014-12-28 13:48:18
你是要菌落PCR鉴定吗，一般这个我只用Taq酶不用pfu酶。目前这个体系我来说一些拙见：变性时间加长至1min，延伸时间缩短至1min。还是不行再说...

好的，谢谢！我试试
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7楼2014-12-28 13:59:22
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-28 23:06:16
退火温度不用变，延伸时间要缩短（建议延伸50 s — 1 min即可），循环次数可以增加（30 — 35个循环）。另外，就你图上这个量做后续实验也够了啊。
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没有做不到，只有想不到！
8楼2014-12-28 14:26:59
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
tianti_121: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-30 09:38:49
菌液量加1ul就可以了。别的不用变。
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10楼2014-12-28 14:32:33
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