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0525bbmj

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求PCR条件优化 已有5人参与

PCR之后的电泳图成这个样子 到底是什么地方有问题呀？PCR反应体系25ul  模板6ul  酶0.2ul  上下引物各2.5ul（10um）Mg2+ 2.5ul（20mm）dNTP 5ul （1mm）5*PCR buffer 5ul  PCR反应条件：95℃ 3min、95℃  30s、退火30s、72℃ 30s、72℃ 7min
电泳条件：3%琼脂糖、500bp Maeker

求PCR条件优化
2014.4.11.gif
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1楼 2014-04-11 18:43:57
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冉兆星

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
0525bbmj(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:16:24
marker跑的不整齐，可能是TE缓冲液有问题，建议更换TE缓冲液。还有就是你为什么做那么高浓度的琼脂糖胶？
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2楼2014-04-11 19:33:58
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
0525bbmj(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:16:32
你这个PCR体系中很多东西都过量了，引物10uM的只要加1ul就好，dNTP 20mM的加0.5ul就可以，我不知道你的模板浓度是多少，定个量加50ng吧。
另，琼脂糖凝胶没必要配那么浓的吧，根据你的延伸条件，你的目的片段应该在500-1K左右，配1%的胶就可以了，另外，胶尽量多熔会，配均匀点，你的这个胶均匀性不好。
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3楼2014-04-12 08:37:22
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lingsheshidu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从图片看，问题出在制胶/电泳，因为你的Marker跑的效果也不好！
可能原因：（1）电压太大，胶浓度偏高，建议用较低电压跑电泳，5-8V/cm效果应该不会差的。(2)胶浓度过高，如果你的片段在300-500bp，2%胶应该就可以了。（3）胶制的不均匀，从胶上的星星点点可以看出，按楼上朋友所说多熔一会儿，使溶解均匀。此外，PCR体系中确实有些浓度是过量的，10uM引物各加0.5-1uL即可。Mg2+(20mM)加2uL足以。模板量用uL表示其实是不科学的，模板是质粒的话0.1-10 ng足以，当然了，适当多些也没问题，但超过100ng就已经没什么必要了，而且随着模板量再大反而效果可能会更差，模板6uL无法判断是否过量，但是从楼主的风格和电泳图判断，应该也是过量的，重新调整吧，祝顺利！
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积累知识，抓紧奋斗！
4楼2014-04-12 23:11:40
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0525bbmj

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冉兆星 at 2014-04-11 19:33:58
marker跑的不整齐，可能是TE缓冲液有问题，建议更换TE缓冲液。还有就是你为什么做那么高浓度的琼脂糖胶？

我的marker分子量很小 是500的 要求的琼脂糖浓度就比较高 低的浓度跑的也不好
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5楼2014-04-13 09:06:06
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0525bbmj

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-12 08:37:22
你这个PCR体系中很多东西都过量了，引物10uM的只要加1ul就好，dNTP 20mM的加0.5ul就可以，我不知道你的模板浓度是多少，定个量加50ng吧。
另，琼脂糖凝胶没必要配那么浓的吧，根据你的延伸条件，你的目的片段应该在 ...

恩恩 我调整下再试试 谢谢呀
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6楼2014-04-13 09:07:27
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0525bbmj

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lingsheshidu at 2014-04-12 23:11:40
从图片看，问题出在制胶/电泳，因为你的Marker跑的效果也不好！
可能原因：（1）电压太大，胶浓度偏高，建议用较低电压跑电泳，5-8V/cm效果应该不会差的。(2)胶浓度过高，如果你的片段在300-500bp，2%胶应该就可以 ...

恩恩 太感谢了 ！
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7楼2014-04-13 09:11:33
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
0525bbmj: 金币+2, ★有帮助 2014-05-20 21:17:59
应该是P出来你想要的条带了，不过Maker明显也跑的不好，可能是胶或者缓冲液的问题。。。
另外PCR条件，我觉得酶可以加到0.5ul，引物各1ul，其余应该没问题了，还有你延伸的时间是不是可以调整一下，根据你目的片段大小
最后，你可以用PCR产物重新用新的胶和缓冲液电泳一次。。。
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8楼2014-04-14 14:19:51
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zhangtao110

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
补充一个，你电泳时间太短了，二甲苯青也就是最快的那条带跑到三分之二差不多就可以了

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-04-14 15:26:39
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