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求PCR条件优化已有5人参与
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PCR之后的电泳图成这个样子 到底是什么地方有问题呀？PCR反应体系25ul 模板6ul 酶0.2ul 上下引物各2.5ul（10um）Mg2+ 2.5ul（20mm）dNTP 5ul （1mm）5*PCR buffer 5ul PCR反应条件：95℃ 3min、95℃ 30s、退火30s、72℃ 30s、72℃ 7min 电泳条件：3%琼脂糖、500bp Maeker  2014.4.11.gif |
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d00614028
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3楼2014-04-12 08:37:22
2楼2014-04-11 19:33:58
lingsheshidu
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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从图片看，问题出在制胶/电泳，因为你的Marker跑的效果也不好！ 可能原因：（1）电压太大，胶浓度偏高，建议用较低电压跑电泳，5-8V/cm效果应该不会差的。(2)胶浓度过高，如果你的片段在300-500bp，2%胶应该就可以了。（3）胶制的不均匀，从胶上的星星点点可以看出，按楼上朋友所说多熔一会儿，使溶解均匀。此外，PCR体系中确实有些浓度是过量的，10uM引物各加0.5-1uL即可。Mg2+(20mM)加2uL足以。模板量用uL表示其实是不科学的，模板是质粒的话0.1-10 ng足以，当然了，适当多些也没问题，但超过100ng就已经没什么必要了，而且随着模板量再大反而效果可能会更差，模板6uL无法判断是否过量，但是从楼主的风格和电泳图判断，应该也是过量的，重新调整吧，祝顺利！ |
4楼2014-04-12 23:11:40
5楼2014-04-13 09:06:06