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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] PCR条件,请指导。已有4人参与

大家好,
最近进行PCR扩增,产物大小理论值为1580bp,用到的PCR条件为下列两种:
①94℃   5min;94℃   30s,55℃   30s,72℃   1.5min;72℃ 10min;
②94℃   5min;94℃   30s,55℃   1.5min,72℃   30s;72℃ 10min;

让人纠结的是用①正常的PCR条件尝试各种方法就是P不出条带(也做过梯度PCR45-57℃),
但是因为一个意外PCR条件采用了②条件,扩增出了正确的产物。
对此想请教为什么错误的条件②可以P出正确产物,且以后的验证实验是不是也需要采取②条件。
谢谢!
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百代繁华一朝都,谁非过客;千秋明月吹角寒,花是主人;江山图一快,人,不见血,刀,不收锋。
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉是引物Tm值低,或者酶活力不好,循环中的变性条件94℃/1 min就够了。
9楼2014-04-07 10:13:14
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普通回帖

867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
ming0515(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:22:31
ming0515: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-04-07 16:55:43
如果lz两个pcr条件,只是各个温度时间长短不一样,而TM值等其他条件都一样,那么既然可以得出正确条带,以后验证时当然也用这个条件。
有些东西因为得不到而变得美好,有些东西因为拥有而变得弥足珍贵!
2楼2014-04-06 11:21:19
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apety

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ming0515: 金币+1 2014-04-07 16:55:56
72℃搞2Min,55℃1Min。话说,你用的的是mix还是自己混合的?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-04-06 12:12:05
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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 867575969 at 2014-04-06 11:21:19
如果lz两个pcr条件,只是各个温度时间长短不一样,而TM值等其他条件都一样,那么既然可以得出正确条带,以后验证时当然也用这个条件。

关键是,条件②不是正常的PCR条件啊,因为退火时间和延伸时间是相反的。。。
百代繁华一朝都,谁非过客;千秋明月吹角寒,花是主人;江山图一快,人,不见血,刀,不收锋。
4楼2014-04-06 12:22:43
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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by apety at 2014-04-06 12:12:05
72℃搞2Min,55℃1Min。话说,你用的的是mix还是自己混合的?

自己混合的,正常条带的延伸时间1Kb/min,
但是用正常的①条件,P不出条带,而②条件却可以,对此不懂。
百代繁华一朝都,谁非过客;千秋明月吹角寒,花是主人;江山图一快,人,不见血,刀,不收锋。
5楼2014-04-06 12:24:19
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 2 2014-04-06 23:47:58
ming0515: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2014-04-07 16:56:13
55°C的时候,Taq酶还是有活性的,就是说55度的时候,除了引物配对之外,还有延伸的作用,只是速度比较慢而已,72度只有延伸,引物和模板是无法配对的。
行至水穷处,坐看云起时
6楼2014-04-06 16:46:55
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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2014-04-06 16:46:55
55°C的时候,Taq酶还是有活性的,就是说55度的时候,除了引物配对之外,还有延伸的作用,只是速度比较慢而已,72度只有延伸,引物和模板是无法配对的。

那按照您的意思,55℃即进行了退火,有包含延伸。那么我的②PCR条件是不是可以去掉72℃ 30s,这一步,从而改成两步法。
百代繁华一朝都,谁非过客;千秋明月吹角寒,花是主人;江山图一快,人,不见血,刀,不收锋。
7楼2014-04-06 21:32:10
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖


ming0515: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-04-07 16:56:26
如果你把55度的时间延长足够,这样72度这一步就可以省略了。
行至水穷处,坐看云起时
8楼2014-04-06 22:02:09
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
9楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-04-07 10:13:14
感觉是引物Tm值低,或者酶活力不好,循环中的变性条件94℃/1 min就够了。

看错了,94℃/30 s
10楼2014-04-07 10:14:17
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