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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 各位大侠，荧光定量中怎么设置检测荧光的温度呢
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qureen

新虫 (初入文坛)

[求助] 各位大侠，荧光定量中怎么设置检测荧光的温度呢

各位大侠，我看到说提高检测荧光的温度可以避免二聚体的产生，请问这个荧光检测温度怎么设置呢？
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1楼 2013-09-06 15:54:24
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-10 15:13:46
raeltime-PCR？你确定说法是提高检测荧光温度？还是提高退火温度的意思？因为即使荧光检测部分不工作（检测荧光温度无视）PCR条件不变，二聚体的产生就不变吧。LZ说的更详细些。
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2楼2013-09-10 14:42:44
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qureen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-10 14:42:44
raeltime-PCR？你确定说法是提高检测荧光温度？还是提高退火温度的意思？因为即使荧光检测部分不工作（检测荧光温度无视）PCR条件不变，二聚体的产生就不变吧。LZ说的更详细些。

我是想提高检测荧光的温度，设计了好几对引物，但做荧光定量时都有二聚体，想提高温度不检测二聚体，不知是否可行？
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3楼2013-09-22 23:34:55
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
qureen: 金币+1, ★有帮助 2013-09-23 14:52:08
两步法就两个温度，解链温度（不能检测），退火和延伸温度（一般为60度，检测荧光），如果要改变检测温度必然需要改变退火和延伸温度，或者干脆改为三步法，然后调整退火温度（有人直接用延伸温度检测。。。）
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4楼2013-09-23 10:45:18
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
qureen: 金币+1, ★有帮助 2013-09-23 14:51:57
可不可以先做常规PCR，看退火温度是多少，两步法温度也有60度，如果60度还有很多引物二聚体，那设计真的改改
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2013-09-23 11:27:15
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qureen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-23 10:45:18
两步法就两个温度，解链温度（不能检测），退火和延伸温度（一般为60度，检测荧光），如果要改变检测温度必然需要改变退火和延伸温度，或者干脆改为三步法，然后调整退火温度（有人直接用延伸温度检测。。。）

这个具体怎么设置呢，请指导下！
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6楼2013-09-23 14:49:47
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qureen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by pennchem at 2013-09-23 11:27:15
可不可以先做常规PCR，看退火温度是多少，两步法温度也有60度，如果60度还有很多引物二聚体，那设计真的改改

我做一般PCR的温度是不到60度，是换引物吗？都设计好多对了，二聚体始终都有
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7楼2013-09-23 14:51:24
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hl16010921

木虫 (正式写手)
1.我们一般设计realtime PCR引物Tm都是60度左右，实在不好再调整PCR条件。（设定为60度，是为了一次可以检多个基因，并同内参的条件一致）
2。我们一般先跑普通PCR（但用realtime PCR的条件），如果有引物二聚体先降低引物浓度，不行再改为常规的三步法摸引物的退火温度（有梯度模块的PCR仪，很快就会搞定）
3.根据三步法的条件修改荧光PCR仪的设定。
以上都不行只能重新设计引物了。另外使用内参的话，要同时检测同等条件下内参的扩增情况。
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8楼2013-09-23 19:30:16
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