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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条件，请指导。
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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] PCR条件，请指导。 已有4人参与

大家好，
最近进行PCR扩增，产物大小理论值为1580bp，用到的PCR条件为下列两种：
①94℃   5min；94℃   30s，55℃   30s，72℃   1.5min；72℃ 10min；
②94℃   5min；94℃   30s，55℃   1.5min，72℃   30s；72℃ 10min；

让人纠结的是用①正常的PCR条件尝试各种方法就是P不出条带（也做过梯度PCR45-57℃），
但是因为一个意外PCR条件采用了②条件，扩增出了正确的产物。
对此想请教为什么错误的条件②可以P出正确产物，且以后的验证实验是不是也需要采取②条件。
谢谢！
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百代繁华一朝都，谁非过客；千秋明月吹角寒，花是主人；江山图一快，人，不见血，刀，不收锋。
1楼 2014-04-06 09:50:44
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是引物Tm值低，或者酶活力不好，循环中的变性条件94℃/1 min就够了。
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9楼2014-04-07 10:13:14
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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ming0515(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:22:31
ming0515: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-04-07 16:55:43
如果lz两个pcr条件，只是各个温度时间长短不一样，而TM值等其他条件都一样，那么既然可以得出正确条带，以后验证时当然也用这个条件。
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有些东西因为得不到而变得美好，有些东西因为拥有而变得弥足珍贵！
2楼2014-04-06 11:21:19
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apety

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ming0515: 金币+1 2014-04-07 16:55:56
72℃搞2Min，55℃1Min。话说，你用的的是mix还是自己混合的？

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-04-06 12:12:05
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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 867575969 at 2014-04-06 11:21:19
如果lz两个pcr条件，只是各个温度时间长短不一样，而TM值等其他条件都一样，那么既然可以得出正确条带，以后验证时当然也用这个条件。

关键是，条件②不是正常的PCR条件啊，因为退火时间和延伸时间是相反的。。。
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4楼2014-04-06 12:22:43
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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by apety at 2014-04-06 12:12:05
72℃搞2Min，55℃1Min。话说，你用的的是mix还是自己混合的？

自己混合的，正常条带的延伸时间1Kb/min，
但是用正常的①条件，P不出条带，而②条件却可以，对此不懂。
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5楼2014-04-06 12:24:19
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 2 2014-04-06 23:47:58
ming0515: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2014-04-07 16:56:13
55°C的时候，Taq酶还是有活性的，就是说55度的时候，除了引物配对之外，还有延伸的作用，只是速度比较慢而已，72度只有延伸，引物和模板是无法配对的。
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2014-04-06 16:46:55
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ming0515

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2014-04-06 16:46:55
55°C的时候，Taq酶还是有活性的，就是说55度的时候，除了引物配对之外，还有延伸的作用，只是速度比较慢而已，72度只有延伸，引物和模板是无法配对的。

那按照您的意思，55℃即进行了退火，有包含延伸。那么我的②PCR条件是不是可以去掉72℃ 30s，这一步，从而改成两步法。
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百代繁华一朝都，谁非过客；千秋明月吹角寒，花是主人；江山图一快，人，不见血，刀，不收锋。
7楼2014-04-06 21:32:10
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
ming0515: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-04-07 16:56:26
如果你把55度的时间延长足够，这样72度这一步就可以省略了。
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行至水穷处，坐看云起时
8楼2014-04-06 22:02:09
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-04-07 10:13:14
感觉是引物Tm值低，或者酶活力不好，循环中的变性条件94℃/1 min就够了。

看错了，94℃/30 s
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10楼2014-04-07 10:14:17
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