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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带淡，怎样优化？（如图）
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duane

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
tianti_121: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-30 09:39:04
大家都已将条件优化的说完了，但我注意到你的点样孔很亮，我以前遇到点样孔亮的话 一般条带都很淡；但是点样孔不亮的话，条带都很亮。
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11楼2014-12-29 07:59:22
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
tianti_121(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:40
一般退火温度设置为上下引物平均值减去5℃，在这个Tm值之间进行波动，可以将退火温度设置为60℃试一下
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
12楼2014-12-29 08:23:43
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oO晶锅Oo

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Pfu酶的扩增效率低于Taq酶，建议适当延长循环的退火时间，比如1 min，效果会好一些。
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13楼2014-12-29 09:24:24
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lianwenli91

新虫 (初入文坛)
其实你的模板浓度低，可以加1微升，也可以做个降落PCR。
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14楼2014-12-29 16:56:34
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张解放88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:32
看了几个回复感觉很温馨。你的图片我一看，很明显模板（菌液）加入过多，看看加样孔亮度；第二，退火温度过高（没看到你的引物，所有不太好判断），可适当减到58-60℃；第三，Fastpfu酶本身针对性强，产量低，所以建议你做50ul PCR体系。多摸索，经验很重要。
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15楼2014-12-29 19:36:14
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tianti_121

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wu-ke-da at 2014-12-29 08:23:43
一般退火温度设置为上下引物平均值减去5℃，在这个Tm值之间进行波动，可以将退火温度设置为60℃试一下

60度确实P出来了。61也OK
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16楼2014-12-30 09:35:06
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tianti_121

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 张解放88 at 2014-12-29 19:36:14
看了几个回复感觉很温馨。你的图片我一看，很明显模板（菌液）加入过多，看看加样孔亮度；第二，退火温度过高（没看到你的引物，所有不太好判断），可适当减到58-60℃；第三，Fastpfu酶本身针对性强，产量低，所以建 ...

我看了也好温馨啊，第二天菌液增加到1微升，退火温度60，61，64都出了，其他条件不变，好奇怪~不过还是P出来了，开心。谢谢！
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17楼2014-12-30 09:36:51
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灰血动物

金虫 (小有名气)
这是要验证质粒转化的结果么
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未完成
18楼2014-12-30 14:52:49
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aesar9983

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:07
引物二聚体很多，如果要验证连接，直接用Taq酶就可以了
如果是要回收，还是建议重新设计引物
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19楼2015-01-12 17:16:07
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molizerd

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:14
加大模板量，换更好的反应buffer.摸索更好的退火温度。话说你引物加这么多？二聚体好亮，一般情况下我25体系加0.3。

[ 发自小木虫客户端 ]
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20楼2015-01-12 17:29:49
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