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tianti_121

新虫 (小有名气)

[求助] PCR条带淡,怎样优化?(如图) 已有12人参与

菌液PCR,反应体系:菌液0.5,引物各1,Fastpfu buffer 5,dNTP 2.5,Fastpfu酶 0.5,ddH2O 14.5,共25微升。

PCR程序:94℃ 4min,
                 94℃ 30s
                 62℃ 30s
                 72℃ 2min
                 35个循环
                 72℃  10min

目的基因大概1300多bp.

求优化条件!十分感谢!

PCR条带淡,怎样优化?(如图)
高保真菌液PCR.jpg
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张解放88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:32
看了几个回复感觉很温馨。你的图片我一看,很明显模板(菌液)加入过多,看看加样孔亮度;第二,退火温度过高(没看到你的引物,所有不太好判断),可适当减到58-60℃;第三,Fastpfu酶本身针对性强,产量低,所以建议你做50ul PCR体系。多摸索,经验很重要。
15楼2014-12-29 19:36:14
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-28 23:05:11
优化下退火温度吧,一般不会那么高。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2014-12-28 12:03:51
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tianti_121

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-28 12:03:51
优化下退火温度吧,一般不会那么高。

合成的引物上游退火温度62.67,下游67.75。请问设计多少合适?
3楼2014-12-28 12:19:31
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:51
额,那个不准的,一般常用是54-56,极端情况可以更高或更低。我一般前用54度试试,不行就做退火温度梯度。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2014-12-28 12:30:47
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