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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带淡，怎样优化？（如图）
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tianti_121

新虫 (小有名气)

[求助] PCR条带淡，怎样优化？（如图） 已有12人参与

菌液PCR，反应体系：菌液0.5，引物各1，Fastpfu buffer 5，dNTP 2.5，Fastpfu酶 0.5，ddH2O 14.5，共25微升。

PCR程序：94℃ 4min，
                 94℃ 30s
                 62℃ 30s
                 72℃ 2min
                 35个循环
                 72℃  10min

目的基因大概1300多bp.

求优化条件！十分感谢！

PCR条带淡，怎样优化？（如图）
高保真菌液PCR.jpg
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1楼 2014-12-28 11:18:35
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tianti_121

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aotoulan at 2014-12-28 13:48:18
你是要菌落PCR鉴定吗，一般这个我只用Taq酶不用pfu酶。目前这个体系我来说一些拙见：变性时间加长至1min，延伸时间缩短至1min。还是不行再说...

好的，谢谢！我试试
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7楼2014-12-28 13:59:22
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-28 23:05:11
优化下退火温度吧，一般不会那么高。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-12-28 12:03:51
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tianti_121

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-28 12:03:51
优化下退火温度吧，一般不会那么高。

合成的引物上游退火温度62.67，下游67.75。请问设计多少合适？
赞一下 回复此楼
3楼2014-12-28 12:19:31
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:06:51
额，那个不准的，一般常用是54-56，极端情况可以更高或更低。我一般前用54度试试，不行就做退火温度梯度。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-12-28 12:30:47
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