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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么电转后筛菌，然后用通用引物PCR，但是空GS115都PCR不出条带？跪求！回复！！
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笨笨和傻猪

银虫 (小有名气)

[求助] 为什么电转后筛菌，然后用通用引物PCR，但是空GS115都PCR不出条带？跪求！回复！！ 已有5人参与

我是电转整合型载体PpiczaA到毕赤酵母GS115中的，但是电转化完成后，进行筛菌。然后想通过菌落PCR先筛选一部分，以下是我的PCR方法及条件：
        1）我采用的用未做电转的空菌GS115做对照，挑取平板上的菌用宝生物的lysis buffer（code ：9760）裂解的，然后取1ul进行的PCR,用的是宝生物的Taq酶，50ul体系
        2)体系为：taq（5u/ml）：   0.25ul                        PCR条件：94℃            10min
                       10×PCR buffer：   5ul                                          94℃             30s
                       dNTPs（各2.5mM）：4ul                                      54℃            30s
                        模板为：               1ul                                        72℃             3min40s
                       3AOX（10uM）：   1ul                                         72℃              7min
                       5AOX(10UM）：     1ul                                        30个循环
                       灭菌水：              47.5ul
           跪求各位原因啊，哎，什么条带也不出，我尝试了好几次裂解方式，仍旧如此
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1楼 2014-11-13 17:58:21
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笨笨和傻猪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by MLN10000 at 2014-11-17 11:19:23
你目的片段是多大

3000多bp
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7楼2014-11-17 19:33:45
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-14 14:07:51
你水加多了，明显不止50微升。如果是笔误，那你换套系统试试吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-11-13 19:25:01
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笨笨和傻猪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-11-13 19:25:01
你水加多了，明显不止50微升。如果是笔误，那你换套系统试试吧。

写错了，34.25u l水
赞一下 回复此楼
3楼2014-11-14 08:46:20
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jjwhl

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-18 12:01:07
做菌落PCR，直接挑取单菌落至20ul无菌水，煮沸10min，即为模板。再一个模板太少了，50ul体系最少来个4ul模板
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4楼2014-11-16 16:38:23
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