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H-xiangzhu金虫 (正式写手)
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[求助]
急！PCR产物测序找不到引物已有1人参与
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| 我想做放线菌的16rDNA鉴定，先提取总DNA，PCR产物直接测序，引物采用细菌通用引物，大小在1500bp这样，但是测序结果发现找不到因为序列，请问我该怎么办呢？是什么问题呢？请高手帮忙。非常感谢！ |
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 测序相关问题 |
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10楼2013-01-05 15:47:25
cicelyzh
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2楼2012-12-31 06:14:36
3楼2012-12-31 11:34:09
H-xiangzhu
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4楼2013-01-02 22:03:18
5楼2013-01-03 12:09:04
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+4, 欢迎应助 2013-01-05 17:31:20
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你的PCR产物是1500bp的，测序图片的前100bp的峰都不可信，最后面的电泳峰（800bp以后）峰的信噪比比较低，大峰下面套小峰，都不能认为测到的序列。 如果你想在测序结果中找到引物序列（用上游引物测序的话，测序的结果最后的一段序列中只能找到与下游引物的反向互补序列一致的碱基；反之用下游引物测序，只能找到上游引物的反向互补序列），这是在你测得的序列可信的情况下才能得到的结果。你的PCR产物送去测序，测得的序列绝对不可能得到1500bp的结果的。 所以讲了这么一大堆，如果你想要从测序结果中得到引物序列，一个办法是分段测序，分三段，每500bp测一个，这样得到的序列3个拼接起来就能得到很好的结果了，也能找到你的引物序列了。 |
6楼2013-01-04 15:33:00
H-xiangzhu
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7楼2013-01-05 13:41:59
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+4, 鼓励 应助 2013-01-05 17:31:36
小丹木木: 金币+4, 鼓励 应助 2013-01-05 17:31:36
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双向测通是可以的，所得到的序列可信度是可以的，但也有可能没有你想要看到的引物序列（并不代表你的测序结果失败啊）。你最好详细咨询下测序公司的技术支持，把你的需求跟他们讲下。其实测通就是双向测序结果的数据，他们帮忙拼接好。你也可以自己拼接用Chromas来看峰形，用ContigExpress来做拼接。不可靠序列通过看峰形手工切掉。 你只要记住现在DNA测序一个反应也就能测500bp左右。通用引物1492r/F27，pcr后去测序，因为测序软件的自身原因，测出来开头的序列是杂带不准确，如果需要16sRNA的全长，必须做TA克隆，就需要载体。如果你要求鉴定菌种只到属，就没必要克隆了。 你可以选择27F做上游引物，534r做下游引物，PCR一次得到500bp左右的产物，双向测序就能得到前500bp的准确序列了，以此再找一个16srRNA位置在1000左右的引物序列，3个500bp的PCR产物双向测序就能完美的得到你的整条16srRNA序列了。 |
8楼2013-01-05 15:23:48
H-xiangzhu
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9楼2013-01-05 15:31:44