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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急！PCR产物测序找不到引物
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

连在载体上再测次好了
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一直向前！
11楼2013-01-05 15:55:10
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H-xiangzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lihongbo840427 at 2013-01-05 15:47:25
不用客气的。如果要求很严苛，想要得到的数据用来发表，还是做克隆吧。不做克隆是无法得到全长的16s rRNA序列的。如果只是用来鉴定均属的话，双向测序的结果拼接重合的部分的可信度最高，选取这部分去NCBI进行blast ...

恩呢，懂了，真是非常的感谢~我知道我应该做什么了，另外，还想替我同学请教你一个问题，他提取小型昆虫总DNA，可是测序回来后经常有套峰，他想请教怎么可以避免这样呢？
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共同学习，一起进步
12楼2013-01-05 16:48:18
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lihongbo840427

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by H-xiangzhu at 2013-01-05 16:48:18
恩呢，懂了，真是非常的感谢~我知道我应该做什么了，另外，还想替我同学请教你一个问题，他提取小型昆虫总DNA，可是测序回来后经常有套峰，他想请教怎么可以避免这样呢？...

测序出现套峰的原因是你送去测序的DNA（PCR产物）不纯，样品中含有不止一种DNA。不知道你同学送测序的是什么样品。送之前是否经过琼脂糖凝胶电泳检测，是否为单一条带呢？
要避免这种情况，主要从设计的引物的特异性着手，选择更特异的引物来PCR，得到的PCR产物经电泳检测是单一条带，再去测序看看。
希望能帮到你。
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13楼2013-01-05 17:41:37
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东方晓

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lihongbo840427 at 2013-01-05 15:47:25
不用客气的。如果要求很严苛，想要得到的数据用来发表，还是做克隆吧。不做克隆是无法得到全长的16s rRNA序列的。如果只是用来鉴定均属的话，双向测序的结果拼接重合的部分的可信度最高，选取这部分去NCBI进行blast ...

是做过克隆测的序，若是发现引物序列处于中间位置，这种改怎么办？
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14楼2013-03-25 20:27:52
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lihongbo840427

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 东方晓 at 2013-03-25 20:27:52
是做过克隆测的序，若是发现引物序列处于中间位置，这种改怎么办？...

你的目的是做什么？克隆后得到测序结果很容易分辨载体和插入的序列的啊
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15楼2013-03-26 18:07:08
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东方晓

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lihongbo840427 at 2013-03-26 18:07:08
你的目的是做什么？克隆后得到测序结果很容易分辨载体和插入的序列的啊...

为了建立克隆文库。因为我没有做嵌合体检测（不会），直接处理了所测的序列，我在txt上手动去除引物序列，发现有引物序列处于将近中间位置的。然后我在blast上比对了一下，发现它与一些vector相似度高，我就觉得其中有问题。
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16楼2013-03-27 15:55:18
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东方晓

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lihongbo840427 at 2013-03-26 18:07:08
你的目的是做什么？克隆后得到测序结果很容易分辨载体和插入的序列的啊...

如何辨别载体和插入序列？
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17楼2013-03-27 15:56:34
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希罗雅

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lihongbo840427 at 2013-01-04 15:33:00
你的PCR产物是1500bp的，测序图片的前100bp的峰都不可信，最后面的电泳峰（800bp以后）峰的信噪比比较低，大峰下面套小峰，都不能认为测到的序列。
如果你想在测序结果中找到引物序列（用上游引物测序的话，测序的 ...

现在测序基本上能够保证前800bp是可用的，但是由于刚出峰的几十bp也是不准的，所以或许要测3个反应。
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凡事学习
18楼2014-06-03 14:09:39
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