[交流] 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？

9楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-02 12:05:24
但是引物不是新合成的。。。以前也是用的这个反向引物，现在用的是以前剩下的...

6楼: Originally posted by virus2009 at 2012-11-02 10:26:05
你的反向是重新合成的还是你之前留下的？如果是重新合成的那可以考虑一下是不是合成错了引物，这个你可以让合成公司再帮你合成一对，确保引物无误后再分析。

5楼: Originally posted by yasmineross at 2012-11-02 09:13:39
如果测序结果没有问题的话，就是引物的质量问题了。

LZ一直说引物以前用过，是以前用过这个引物序列，还是一直用的同一支引物？

如果是根据老序列新合成的引物，那就是引物序列上有突变吧。

3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 07:12:35
即使模板突变了，P出来的东西应该是和引物序列一致的。因为模板的浓度很低，合成出来的DNA大量扩增都应该是引物序列。我怀疑你的引物错了，需要把引物测序鉴定一下。

10楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 12:43:24
定引物的时候如果不要求过柱纯化的话公司只是做脱盐处理。有可能是合成的引物不是全长甚至错误的可能。因为HPLC或者RPC纯化的引物比较贵，做一般PCR大家都不选这个服务。可能你的引物不纯，有错误。据我的经验，从 ...

11楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-02 13:13:48
但是这个引物以前真的用过。。。都用来做了两个构建了 完全是正确的、、而且也不是新合成的，是以前冻存的...

13楼: Originally posted by polepolar at 2012-11-02 23:24:10
如果出现的突变距离你的引物3`端小于10个碱基,基本可以肯定是模板上的;如果多于10个碱基,则应该是引物的问题.

16楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-11-03 10:27:07
你是怎么测序的？连到T载体吗？连到T载体的话，测序引物区应该可以测出来。如果是PCR产物直接测序，那引物区的测序结果不予考虑的。

15楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-03 07:21:07
很的意思说是引物不纯。公司合成出来的引物可能有不同的分子。重新定一个引物又不贵。...

19楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-03 22:37:53
引物不纯的话  同样的反向引物前两次构建的东西都没错 运气也太好了点。。。。...

20楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-04 03:37:32
也可能是这次运气不好呢。做克隆有时候不能用概率来计算的，正确就是正确，错了也没办法。我建议你再定一次引物重新做。...

22楼: Originally posted by 张浩1988 at 2012-12-25 20:25:53
建议先表达，诱导一下很快的。