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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？

让师弟做一个构建，引物是我设计的，并且这个反向引物以前用来做过两个构建，测序完全正确的（这点非常重要）！！！
PS：这个引物被我拿来通用做了几个构建，因为选择的质粒载体和酶切位点都没变，只是正向引物修改了。

目前的问题是，师弟拿这个反向引物做构建，测序发现老是在反向引物那一段，每次测序相同的位点反生了两个突变！！！

引物区段上怎么可能突变啊！！！不可能是引物错了，因为之前用这个反向引物测序都是正确的！！！

然后师弟再做了一次，三个单菌落，测序结果一样，还是反向引物那里错了！

我都凌乱了！！！我只能说是模版突变了！（模版是实验室传了一年半多的菌，提的质粒）！！难道真的突变了两个位点？
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1楼 2012-11-02 00:23:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-02 13:58:30
引用回帖:
9楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-02 12:05:24
但是引物不是新合成的。。。以前也是用的这个反向引物，现在用的是以前剩下的...

定引物的时候如果不要求过柱纯化的话公司只是做脱盐处理。有可能是合成的引物不是全长甚至错误的可能。因为HPLC或者RPC纯化的引物比较贵，做一般PCR大家都不选这个服务。可能你的引物不纯，有错误。据我的经验，从公司定的引物是有可能有错误碱基的。
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10楼2012-11-02 12:43:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
即使模板突变了，P出来的东西应该是和引物序列一致的。因为模板的浓度很低，合成出来的DNA大量扩增都应该是引物序列。我怀疑你的引物错了，需要把引物测序鉴定一下。
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3楼2012-11-02 07:12:35
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竹子小小

木虫 (小有名气)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
看看测序图的峰是不是重叠的。可能是测序问题。
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4楼2012-11-02 08:39:16
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yasmineross

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-02 13:58:18
如果测序结果没有问题的话，就是引物的质量问题了。

LZ一直说引物以前用过，是以前用过这个引物序列，还是一直用的同一支引物？

如果是根据老序列新合成的引物，那就是引物序列上有突变吧。
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5楼2012-11-02 09:13:39
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virus2009

金虫 (正式写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
你的反向是重新合成的还是你之前留下的？如果是重新合成的那可以考虑一下是不是合成错了引物，这个你可以让合成公司再帮你合成一对，确保引物无误后再分析。
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6楼2012-11-02 10:26:05
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by virus2009 at 2012-11-02 10:26:05
你的反向是重新合成的还是你之前留下的？如果是重新合成的那可以考虑一下是不是合成错了引物，这个你可以让合成公司再帮你合成一对，确保引物无误后再分析。

反向引物不是重新合成的，以前我自己合成的，分装了很多冻在-20。。。。所以觉得很奇怪
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7楼2012-11-02 12:02:39
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yasmineross at 2012-11-02 09:13:39
如果测序结果没有问题的话，就是引物的质量问题了。

LZ一直说引物以前用过，是以前用过这个引物序列，还是一直用的同一支引物？

如果是根据老序列新合成的引物，那就是引物序列上有突变吧。

引物不是新合成的，就是以前没用完的反向引物，100uM分装保存在-20℃的。。。。。。。难道冻存也会引入突变？
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8楼2012-11-02 12:04:13
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 07:12:35
即使模板突变了，P出来的东西应该是和引物序列一致的。因为模板的浓度很低，合成出来的DNA大量扩增都应该是引物序列。我怀疑你的引物错了，需要把引物测序鉴定一下。

但是引物不是新合成的。。。以前也是用的这个反向引物，现在用的是以前剩下的
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9楼2012-11-02 12:05:24
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 12:43:24
定引物的时候如果不要求过柱纯化的话公司只是做脱盐处理。有可能是合成的引物不是全长甚至错误的可能。因为HPLC或者RPC纯化的引物比较贵，做一般PCR大家都不选这个服务。可能你的引物不纯，有错误。据我的经验，从 ...

但是这个引物以前真的用过。。。都用来做了两个构建了 完全是正确的、、而且也不是新合成的，是以前冻存的
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11楼2012-11-02 13:13:48
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btx362237729

金虫 (正式写手)
这个问题是不是无解了？
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12楼2012-11-02 16:28:28
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polepolar

银虫 (初入文坛)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
如果出现的突变距离你的引物3`端小于10个碱基,基本可以肯定是模板上的;如果多于10个碱基,则应该是引物的问题.
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13楼2012-11-02 23:24:10
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as023

银虫 (小有名气)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
我觉得是引物有问题
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14楼2012-11-03 00:03:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-02 13:13:48
但是这个引物以前真的用过。。。都用来做了两个构建了 完全是正确的、、而且也不是新合成的，是以前冻存的...

很的意思说是引物不纯。公司合成出来的引物可能有不同的分子。重新定一个引物又不贵。
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15楼2012-11-03 07:21:07
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wangqi20092

新虫 (小有名气)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
你是怎么测序的？连到T载体吗？连到T载体的话，测序引物区应该可以测出来。如果是PCR产物直接测序，那引物区的测序结果不予考虑的。
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16楼2012-11-03 10:27:07
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by polepolar at 2012-11-02 23:24:10
如果出现的突变距离你的引物3`端小于10个碱基,基本可以肯定是模板上的;如果多于10个碱基,则应该是引物的问题.

没有距离我的引物3‘端小于10个碱基或者多于10个碱基。。。因为突变位点就在引物内部的。。。还没超出引物的范围
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17楼2012-11-03 22:35:51
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-11-03 10:27:07
你是怎么测序的？连到T载体吗？连到T载体的话，测序引物区应该可以测出来。如果是PCR产物直接测序，那引物区的测序结果不予考虑的。

目的基因连接到pcDNA3.1(+)里面去测序的。。。。。。。。引物区段错了
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18楼2012-11-03 22:36:57
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-03 07:21:07
很的意思说是引物不纯。公司合成出来的引物可能有不同的分子。重新定一个引物又不贵。...

引物不纯的话  同样的反向引物前两次构建的东西都没错 运气也太好了点。。。。
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19楼2012-11-03 22:37:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
19楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-03 22:37:53
引物不纯的话  同样的反向引物前两次构建的东西都没错 运气也太好了点。。。。...

也可能是这次运气不好呢。做克隆有时候不能用概率来计算的，正确就是正确，错了也没办法。我建议你再定一次引物重新做。
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20楼2012-11-04 03:37:32
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-04 03:37:32
也可能是这次运气不好呢。做克隆有时候不能用概率来计算的，正确就是正确，错了也没办法。我建议你再定一次引物重新做。...

哎 没办法啊 只好重新合成引物了 太纠结了
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21楼2012-11-04 13:57:30
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张浩1988

新虫 (初入文坛)
建议先表达，诱导一下很快的。
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22楼2012-12-25 20:25:53
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 张浩1988 at 2012-12-25 20:25:53
建议先表达，诱导一下很快的。

呵呵 得出结论了 是模版载体错了。。。。
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23楼2012-12-26 15:03:12
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张咖喱2楼
2012-11-02 01:14   回复  
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