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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？

让师弟做一个构建，引物是我设计的，并且这个反向引物以前用来做过两个构建，测序完全正确的（这点非常重要）！！！
PS：这个引物被我拿来通用做了几个构建，因为选择的质粒载体和酶切位点都没变，只是正向引物修改了。

目前的问题是，师弟拿这个反向引物做构建，测序发现老是在反向引物那一段，每次测序相同的位点反生了两个突变！！！

引物区段上怎么可能突变啊！！！不可能是引物错了，因为之前用这个反向引物测序都是正确的！！！

然后师弟再做了一次，三个单菌落，测序结果一样，还是反向引物那里错了！

我都凌乱了！！！我只能说是模版突变了！（模版是实验室传了一年半多的菌，提的质粒）！！难道真的突变了两个位点？
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1楼 2012-11-02 00:23:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-02 13:58:30
引用回帖:
9楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-02 12:05:24
但是引物不是新合成的。。。以前也是用的这个反向引物，现在用的是以前剩下的...

定引物的时候如果不要求过柱纯化的话公司只是做脱盐处理。有可能是合成的引物不是全长甚至错误的可能。因为HPLC或者RPC纯化的引物比较贵，做一般PCR大家都不选这个服务。可能你的引物不纯，有错误。据我的经验，从公司定的引物是有可能有错误碱基的。
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10楼2012-11-02 12:43:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
即使模板突变了，P出来的东西应该是和引物序列一致的。因为模板的浓度很低，合成出来的DNA大量扩增都应该是引物序列。我怀疑你的引物错了，需要把引物测序鉴定一下。
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3楼2012-11-02 07:12:35
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竹子小小

木虫 (小有名气)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
看看测序图的峰是不是重叠的。可能是测序问题。
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4楼2012-11-02 08:39:16
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yasmineross

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-02 13:58:18
如果测序结果没有问题的话，就是引物的质量问题了。

LZ一直说引物以前用过，是以前用过这个引物序列，还是一直用的同一支引物？

如果是根据老序列新合成的引物，那就是引物序列上有突变吧。
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5楼2012-11-02 09:13:39
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