[交流] 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？

让师弟做一个构建，引物是我设计的，并且这个反向引物以前用来做过两个构建，测序完全正确的（这点非常重要）！！！
PS：这个引物被我拿来通用做了几个构建，因为选择的质粒载体和酶切位点都没变，只是正向引物修改了。

目前的问题是，师弟拿这个反向引物做构建，测序发现老是在反向引物那一段，每次测序相同的位点反生了两个突变！！！

引物区段上怎么可能突变啊！！！不可能是引物错了，因为之前用这个反向引物测序都是正确的！！！

然后师弟再做了一次，三个单菌落，测序结果一样，还是反向引物那里错了！

我都凌乱了！！！我只能说是模版突变了！（模版是实验室传了一年半多的菌，提的质粒）！！难道真的突变了两个位点？

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1楼 2012-11-02 00:23:53

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btx362237729

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引用回帖:

10楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 12:43:24
定引物的时候如果不要求过柱纯化的话公司只是做脱盐处理。有可能是合成的引物不是全长甚至错误的可能。因为HPLC或者RPC纯化的引物比较贵，做一般PCR大家都不选这个服务。可能你的引物不纯，有错误。据我的经验，从 ...

但是这个引物以前真的用过。。。都用来做了两个构建了完全是正确的、、而且也不是新合成的，是以前冻存的