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btx362237729

金虫 (正式写手)


[交流] 构建载体测序,老在引物区段发生相同的错误,模版有突变?

让师弟做一个构建,引物是我设计的,并且这个反向引物以前用来做过两个构建,测序完全正确的(这点非常重要)!!!
PS:这个引物被我拿来通用做了几个构建,因为选择的质粒载体和酶切位点都没变,只是正向引物修改了。

目前的问题是,师弟拿这个反向引物做构建,测序发现老是在反向引物那一段,每次测序相同的位点反生了两个突变!!!

引物区段上怎么可能突变啊!!!不可能是引物错了,因为之前用这个反向引物测序都是正确的!!!

然后师弟再做了一次,三个单菌落,测序结果一样,还是反向引物那里错了!

我都凌乱了!!!我只能说是模版突变了!(模版是实验室传了一年半多的菌,提的质粒)!!难道真的突变了两个位点?
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


引用回帖:
19楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-03 22:37:53
引物不纯的话  同样的反向引物前两次构建的东西都没错 运气也太好了点。。。。...

也可能是这次运气不好呢。做克隆有时候不能用概率来计算的,正确就是正确,错了也没办法。我建议你再定一次引物重新做。
20楼2012-11-04 03:37:32
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查看全部 23 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)



btx362237729(金币+1): 谢谢参与
即使模板突变了,P出来的东西应该是和引物序列一致的。因为模板的浓度很低,合成出来的DNA大量扩增都应该是引物序列。我怀疑你的引物错了,需要把引物测序鉴定一下。
3楼2012-11-02 07:12:35
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竹子小小

木虫 (小有名气)



btx362237729(金币+1): 谢谢参与
看看测序图的峰是不是重叠的。可能是测序问题。
4楼2012-11-02 08:39:16
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yasmineross

铁虫 (小有名气)


★ ★ ★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-02 13:58:18
如果测序结果没有问题的话,就是引物的质量问题了。

LZ一直说引物以前用过,是以前用过这个引物序列,还是一直用的同一支引物?

如果是根据老序列新合成的引物,那就是引物序列上有突变吧。
5楼2012-11-02 09:13:39
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