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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 构建载体测序，老在引物区段发生相同的错误，模版有突变？

让师弟做一个构建，引物是我设计的，并且这个反向引物以前用来做过两个构建，测序完全正确的（这点非常重要）！！！
PS：这个引物被我拿来通用做了几个构建，因为选择的质粒载体和酶切位点都没变，只是正向引物修改了。

目前的问题是，师弟拿这个反向引物做构建，测序发现老是在反向引物那一段，每次测序相同的位点反生了两个突变！！！

引物区段上怎么可能突变啊！！！不可能是引物错了，因为之前用这个反向引物测序都是正确的！！！

然后师弟再做了一次，三个单菌落，测序结果一样，还是反向引物那里错了！

我都凌乱了！！！我只能说是模版突变了！（模版是实验室传了一年半多的菌，提的质粒）！！难道真的突变了两个位点？
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1楼 2012-11-02 00:23:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
19楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-11-03 22:37:53
引物不纯的话  同样的反向引物前两次构建的东西都没错 运气也太好了点。。。。...

也可能是这次运气不好呢。做克隆有时候不能用概率来计算的，正确就是正确，错了也没办法。我建议你再定一次引物重新做。
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20楼2012-11-04 03:37:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
即使模板突变了，P出来的东西应该是和引物序列一致的。因为模板的浓度很低，合成出来的DNA大量扩增都应该是引物序列。我怀疑你的引物错了，需要把引物测序鉴定一下。
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3楼2012-11-02 07:12:35
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竹子小小

木虫 (小有名气)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
看看测序图的峰是不是重叠的。可能是测序问题。
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4楼2012-11-02 08:39:16
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yasmineross

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-02 13:58:18
如果测序结果没有问题的话，就是引物的质量问题了。

LZ一直说引物以前用过，是以前用过这个引物序列，还是一直用的同一支引物？

如果是根据老序列新合成的引物，那就是引物序列上有突变吧。
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5楼2012-11-02 09:13:39
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