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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】急~~测序发现在引物位置发现一个碱基缺失
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

[求助] 【求助】急~~测序发现在引物位置发现一个碱基缺失

表达一个蛋白，高保真酶PCR后克隆到载体上用载体引物测序，单向测完一个反应后发现在引物中间位置有一个碱基缺失，请问这是什么原因？是引物有问题还是测序的问题？是否需要双向测通？我现在还有一个克隆，对它进行测序能够得到正确结果吗？现在需要表达的结果发文章毕业，真是急死人了
上峰图，箭头位置为缺失位置

测序峰图
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1楼 2012-08-25 16:06:58
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haozi1989

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+2, ★有帮助 2012-08-26 09:07:20
看峰图 测序应该没问题。。换家公司测序试试。我们实验室出个引物给合成错误的现象。 你问下你的引物合成公司
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很多我们以为一辈子都不会忘记的事情，就在我们念念不忘的日子里，被我们遗忘了....
2楼2012-08-25 18:17:21
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+1, ★有帮助 2012-08-26 09:07:52
对测序又疑问的时候，最好的办法是：尽量多测一些序列，全部两端测序。这样才有说服力。仅仅一个序列没有统计规律，无法说清具体是测序问题，还是扩增问题。。。。。。
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3楼2012-08-25 21:55:55
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jjg0912

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+2, ★有帮助 2012-08-26 09:05:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-27 13:45:01
对于一个载体构建，我一般都挑4个单克隆用10微升水稀释，一半作菌落PCR。一般转移到一个平板上生长。然后根据PCR结果，提取质粒。一般我每次送两个质粒出去测序，而且一般都是双向测序，这样比较稳妥。一般每次都能拿到一个理想的结果，虽然费点钱，可是节约了时间，提高了效率，感觉还蛮好的。
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4楼2012-08-26 06:16:20
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+2, ★有帮助 2012-08-26 09:01:11
应该是引物设计时搞错了序列，查查合成引物的碱基序列。
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5楼2012-08-26 07:26:35
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mitocam at 2012-08-26 07:26:35
应该是引物设计时搞错了序列，查查合成引物的碱基序列。

我检查过我的引物合成订单，没有问题啊
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6楼2012-08-26 09:04:55
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jjg0912 at 2012-08-26 06:16:20
对于一个载体构建，我一般都挑4个单克隆用10微升水稀释，一半作菌落PCR。一般转移到一个平板上生长。然后根据PCR结果，提取质粒。一般我每次送两个质粒出去测序，而且一般都是双向测序，这样比较稳妥。一般每次都能 ...

你的意思是我应该再测几个克隆？
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7楼2012-08-26 09:06:13
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by haozi1989 at 2012-08-25 18:17:21
看峰图 测序应该没问题。。换家公司测序试试。我们实验室出个引物给合成错误的现象。 你问下你的引物合成公司

如果错误，是这一批引物全部错误还是一部分有错？
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8楼2012-08-26 09:07:13
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-25 21:55:55
对测序又疑问的时候，最好的办法是：尽量多测一些序列，全部两端测序。这样才有说服力。仅仅一个序列没有统计规律，无法说清具体是测序问题，还是扩增问题。。。。。。

可是从峰图上看应该没有问题啊
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9楼2012-08-26 09:08:12
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+2, ★有帮助 2012-08-26 14:58:30
从峰图看，测序没有任何问题，不用再浪费时间测序了，肯定是引物合成时少了一个碱基。不是自己的问题的话，就是引物合成公司给你弄错了，重新合成引物吧。
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10楼2012-08-26 13:11:09
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