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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急！PCR产物测序找不到引物
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H-xiangzhu

金虫 (正式写手)

[求助] 急！PCR产物测序找不到引物已有1人参与

我想做放线菌的16rDNA鉴定，先提取总DNA，PCR产物直接测序，引物采用细菌通用引物，大小在1500bp这样，但是测序结果发现找不到因为序列，请问我该怎么办呢？是什么问题呢？请高手帮忙。非常感谢！
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1楼2012-12-30 23:49:23
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lihongbo840427

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+4, 鼓励 应助 2013-01-05 17:31:36
双向测通是可以的，所得到的序列可信度是可以的，但也有可能没有你想要看到的引物序列（并不代表你的测序结果失败啊）。你最好详细咨询下测序公司的技术支持，把你的需求跟他们讲下。其实测通就是双向测序结果的数据，他们帮忙拼接好。你也可以自己拼接用Chromas来看峰形，用ContigExpress来做拼接。不可靠序列通过看峰形手工切掉。
你只要记住现在DNA测序一个反应也就能测500bp左右。通用引物1492r/F27，pcr后去测序，因为测序软件的自身原因，测出来开头的序列是杂带不准确，如果需要16sRNA的全长，必须做TA克隆，就需要载体。如果你要求鉴定菌种只到属，就没必要克隆了。
你可以选择27F做上游引物，534r做下游引物，PCR一次得到500bp左右的产物，双向测序就能得到前500bp的准确序列了，以此再找一个16srRNA位置在1000左右的引物序列，3个500bp的PCR产物双向测序就能完美的得到你的整条16srRNA序列了。
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8楼2013-01-05 15:23:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测序结果在引物附近的分辨率非常低，给出的序列一般不包括引物，引物后面的十几个碱基也有可能缺失。
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2楼2012-12-31 06:14:36
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lihongbo840427

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目前测序的可信区间在500bp左右，你的产物大小在1500bp。正反引物测序得到的序列的最后是相对的引物的反向互补序列。所以你的测序结果是不可能包含引物序列的。测得长度不够的。
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3楼2012-12-31 11:34:09
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H-xiangzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lihongbo840427 at 2012-12-31 11:34:09
目前测序的可信区间在500bp左右，你的产物大小在1500bp。正反引物测序得到的序列的最后是相对的引物的反向互补序列。所以你的测序结果是不可能包含引物序列的。测得长度不够的。

我是采用了双向测序，那请问我需要做什么呢、？可以达到目的
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4楼2013-01-02 22:03:18
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