| 查看: 4056 | 回复: 8 | ||
linxiaolin08捐助贵宾 (初入文坛)
|
[求助]
关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。已有4人参与
|
|
大家好，最近我在做转化后提取质粒，准备下一步进行双酶切验证后转化表达菌株BL21。但是现在遇到了问题： 目的基因与载体双酶切后连接转化（大肠杆菌28a），涂板后长菌了，我也进行挑菌PCR验证，大概挑了40多个但是只有20多个是阳性的，之后再摇菌准备提取连接后的质粒。第一次摇菌没有摇起来（使用的是挑菌做PCR验证的菌液，可能菌的密度比较小），第二次加大了接菌量（大概有150微升菌液），可是提了两次都没有成功，都是没有我想要的那么大的质粒条带，最上面有一条带，我拿去问老师老师说这是基因组DNA，不是质粒，但是我现在不知道是哪里出了问题。难道是我的菌液污染了？可是摇菌后闻起来就是大肠杆菌的味道，只是摇菌后的菌量相比正常28a摇起来量少。我确定步骤也没问题，因为我们相同时间一起做的用的同样的步骤正常的28a质粒就可以提出来。还有就是我发现一个现象，我用的是碱法抽提，第一步需要离心，离心后的沉淀不是白色，有点儿发粉色的那种，这是为什么呢?除了颜色有问题，其他的后续步骤跟正常一样没有发现有什么差别，再就是最后一步了，沉淀超级少，少到我用5微升DD水溶后浓度还非常低。很苦恼啊，各位大神帮帮我~~~如果是染菌了我需要重新涂板然后挑菌进行PCR验证么？还是说需要重新进行双酶切后连接转化？ |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有50人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
求帮助！基因连接克隆载体后转化大肠杆菌，两天了都没长出菌。。。
已经有10人回复- 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性
已经有11人回复
- 大质粒转化 感受态细胞问题
已经有23人回复
- 克隆转化，转化子就是不含目的基因。
已经有12人回复
- pcxsn质粒连接，转化 不长
已经有7人回复
- 将目的基因连入表达质粒，酶切位点问题
已经有3人回复
- 克隆基因为什么一直连不到载体上
已经有11人回复
- 克隆基因，用PMD19-T载体转天根的感受态细胞，菌落少，测的序列全是空载体，求原因·
已经有21人回复
- 为什么扩了一个抗性基因，连到载体上，这个基因没有表达呢，跪求各个大牛指导！！！
已经有17人回复
- 急求:PCR 产物连接转化 涂板后就是不长 到底是怎么回事啊
已经有5人回复
- 连接转化不长菌是怎么回事？？？
已经有15人回复
- 基因与载体连接转化后涂版长出了菌，提质粒却没有提出来，不知道什么原因？？
已经有17人回复
- 转化感受态后提取质粒，测浓度总是很低
已经有17人回复
- pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
已经有23人回复
- 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题
已经有11人回复
- 质粒提取 酶切 T载体与目的基因
已经有5人回复
- 目的基因的连接与转化
已经有3人回复
- 感受态细胞提取的质粒酶解后为什么带型不一样？
已经有12人回复
- T载体转化DH5之后涂板长不出来是什么原因啊
已经有5人回复
- 构建质粒时 质粒上的ATG与目的基因ATG 的问题
已经有4人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- 目的片段和T1载体连接后转入感受态细胞涂板子总不长菌……
已经有7人回复
- 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
已经有17人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌
已经有11人回复
linxiaolin08
捐助贵宾 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 7.5
- 红花: 1
- 帖子: 41
- 在线: 6.6小时
- 虫号: 3415126
- 注册: 2014-09-14
- 专业: 生物化学
2楼2014-10-21 08:37:47
3楼2014-10-21 10:07:16
海之草
金虫 (小有名气)
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 1413.3
- 红花: 2
- 帖子: 148
- 在线: 126.1小时
- 虫号: 3487334
- 注册: 2014-10-20
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2014-10-21 11:09:50
5楼2014-10-21 11:21:19
linxiaolin08
捐助贵宾 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 7.5
- 红花: 1
- 帖子: 41
- 在线: 6.6小时
- 虫号: 3415126
- 注册: 2014-09-14
- 专业: 生物化学
6楼2014-10-27 09:13:45
小冀-
版主 (著名写手)
- 应助: 713 (博后)
- 贵宾: 3.033
- 金币: 11440.4
- 散金: 1055
- 红花: 82
- 帖子: 2509
- 在线: 445小时
- 虫号: 1521695
- 注册: 2011-12-03
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
- 管辖: 微生物
7楼2014-10-27 10:43:37
linxiaolin08
捐助贵宾 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 7.5
- 红花: 1
- 帖子: 41
- 在线: 6.6小时
- 虫号: 3415126
- 注册: 2014-09-14
- 专业: 生物化学
|
你好，我的目的基因是1119bp，连接体系应该是没问题的，我们实验室用的都是25微升的体系。我做了四个对照： A拿双酶切的质粒产物进行转化，可以证明我的质粒是否被切开，我确定我的酶切酶是好使的（我的酶切位点是EcoRI和XhoI，我之前进行过单酶切验证），结果是长了24个菌落。 B用酶切过的未进行连接反应的双酶切产物进行转化，在这一步中可以证明是否有未被酶切的原始质粒，结果是没有长菌落。 C还以原始质粒为对照，可以检测试验过程中是否有操作问题，结果为长了很多菌落。 D用无抗性平板涂感受态细胞，证明我的感受态细胞没问题。结果是长了菌落的，说明感受态没问题。 最后就是我自己的连接产物，平板上长菌落了，而且很多，没问题，挑菌进行PCR后挑选有条带的进行提取质粒后双酶切，可是结果都显示的是没连上。 我自己分析的原因：1、基因没有加上酶切位点导致我没切开，连不上。2、我的连接酶失效了不好使。 你可以帮我分析一下还有什么原因么？我已经在这呆了很久了...没办法进行下一步...谢谢。感恩！！！ |
8楼2014-11-03 16:45:22
9楼2014-12-24 19:57:51