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linxiaolin08捐助贵宾 (初入文坛)
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关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。 已有4人参与
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大家好，最近我在做转化后提取质粒，准备下一步进行双酶切验证后转化表达菌株BL21。但是现在遇到了问题： 目的基因与载体双酶切后连接转化（大肠杆菌28a），涂板后长菌了，我也进行挑菌PCR验证，大概挑了40多个但是只有20多个是阳性的，之后再摇菌准备提取连接后的质粒。第一次摇菌没有摇起来（使用的是挑菌做PCR验证的菌液，可能菌的密度比较小），第二次加大了接菌量（大概有150微升菌液），可是提了两次都没有成功，都是没有我想要的那么大的质粒条带，最上面有一条带，我拿去问老师老师说这是基因组DNA，不是质粒，但是我现在不知道是哪里出了问题。难道是我的菌液污染了？可是摇菌后闻起来就是大肠杆菌的味道，只是摇菌后的菌量相比正常28a摇起来量少。我确定步骤也没问题，因为我们相同时间一起做的用的同样的步骤正常的28a质粒就可以提出来。还有就是我发现一个现象，我用的是碱法抽提，第一步需要离心，离心后的沉淀不是白色，有点儿发粉色的那种，这是为什么呢?除了颜色有问题，其他的后续步骤跟正常一样没有发现有什么差别，再就是最后一步了，沉淀超级少，少到我用5微升DD水溶后浓度还非常低。很苦恼啊，各位大神帮帮我~~~如果是染菌了我需要重新涂板然后挑菌进行PCR验证么？还是说需要重新进行双酶切后连接转化？ |
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海之草
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