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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。已有4人参与

大家好，最近我在做转化后提取质粒，准备下一步进行双酶切验证后转化表达菌株BL21。但是现在遇到了问题：
    目的基因与载体双酶切后连接转化（大肠杆菌28a），涂板后长菌了，我也进行挑菌PCR验证，大概挑了40多个但是只有20多个是阳性的，之后再摇菌准备提取连接后的质粒。第一次摇菌没有摇起来（使用的是挑菌做PCR验证的菌液，可能菌的密度比较小），第二次加大了接菌量（大概有150微升菌液），可是提了两次都没有成功，都是没有我想要的那么大的质粒条带，最上面有一条带，我拿去问老师老师说这是基因组DNA，不是质粒，但是我现在不知道是哪里出了问题。难道是我的菌液污染了？可是摇菌后闻起来就是大肠杆菌的味道，只是摇菌后的菌量相比正常28a摇起来量少。我确定步骤也没问题，因为我们相同时间一起做的用的同样的步骤正常的28a质粒就可以提出来。还有就是我发现一个现象，我用的是碱法抽提，第一步需要离心，离心后的沉淀不是白色，有点儿发粉色的那种，这是为什么呢?除了颜色有问题，其他的后续步骤跟正常一样没有发现有什么差别，再就是最后一步了，沉淀超级少，少到我用5微升DD水溶后浓度还非常低。很苦恼啊，各位大神帮帮我~~~如果是染菌了我需要重新涂板然后挑菌进行PCR验证么？还是说需要重新进行双酶切后连接转化？
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1楼2014-10-16 08:33:27
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by happydove at 2014-10-21 11:21:19
“大概挑了40多个但是只有20多个是阳性的”请问楼主是用什么方法验证的
双酶切比较可靠，如果是PCR，是否用的是一头通用引物和一头特异引物？

是用菌液PCR验证的，没有用通用引物，只用了特异性引物。不是用特异性引物就可以了么？一定要都PCR一下么？我们实验室一般都是先进行菌液PCR验证，接下来才双酶切...但是我就在提质粒这个地方出了问题。我已经重新酶切重新连接，下午就转化涂板了。希望这次可以有结果。
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6楼2014-10-27 09:13:45
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)
有人可以帮帮我嘛~~~
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2楼2014-10-21 08:37:47
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593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
linxiaolin08: 金币+2 2014-10-27 11:29:33
初步感觉楼主的菌并没有污染，而是楼主插入的基因可能在E.coli 里面表达了，而这种表达产物（蛋白）对细菌具有毒性
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3楼2014-10-21 10:07:16
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海之草

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
linxiaolin08: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-10-27 11:29:27
不知楼主的插入片段有多大，连接体系是不是比例有问题？对于双酶切连接克隆，50%的阳性率感觉有点偏低。楼主有检查过抗生素吗？有没有过期，有没有因为反复冻融而失效？
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4楼2014-10-21 11:09:50
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