应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。
51/1返回列表
查看: 4849  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。 已有4人参与

大家好，最近我在做转化后提取质粒，准备下一步进行双酶切验证后转化表达菌株BL21。但是现在遇到了问题：
    目的基因与载体双酶切后连接转化（大肠杆菌28a），涂板后长菌了，我也进行挑菌PCR验证，大概挑了40多个但是只有20多个是阳性的，之后再摇菌准备提取连接后的质粒。第一次摇菌没有摇起来（使用的是挑菌做PCR验证的菌液，可能菌的密度比较小），第二次加大了接菌量（大概有150微升菌液），可是提了两次都没有成功，都是没有我想要的那么大的质粒条带，最上面有一条带，我拿去问老师老师说这是基因组DNA，不是质粒，但是我现在不知道是哪里出了问题。难道是我的菌液污染了？可是摇菌后闻起来就是大肠杆菌的味道，只是摇菌后的菌量相比正常28a摇起来量少。我确定步骤也没问题，因为我们相同时间一起做的用的同样的步骤正常的28a质粒就可以提出来。还有就是我发现一个现象，我用的是碱法抽提，第一步需要离心，离心后的沉淀不是白色，有点儿发粉色的那种，这是为什么呢?除了颜色有问题，其他的后续步骤跟正常一样没有发现有什么差别，再就是最后一步了，沉淀超级少，少到我用5微升DD水溶后浓度还非常低。很苦恼啊，各位大神帮帮我~~~如果是染菌了我需要重新涂板然后挑菌进行PCR验证么？还是说需要重新进行双酶切后连接转化？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-10-16 08:33:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
linxiaolin08: 金币+2 2014-10-27 11:29:44
个人感觉菌落PCR的效果并没有但双酶切的效果好，PCR没有条带的话可能原因太多了，还是没切验证比较放心···还有就是离心后菌体颜色，基本上都是黄白色的，出现点粉或红色是正常的，并没有染菌···
赞一下 回复此楼
···
7楼2014-10-27 10:43:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)
有人可以帮帮我嘛~~~
赞一下 回复此楼
2楼2014-10-21 08:37:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
linxiaolin08: 金币+2 2014-10-27 11:29:33
初步感觉楼主的菌并没有污染，而是楼主插入的基因可能在E.coli 里面表达了，而这种表达产物（蛋白）对细菌具有毒性
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-10-21 10:07:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

海之草

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
linxiaolin08: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-10-27 11:29:27
不知楼主的插入片段有多大，连接体系是不是比例有问题？对于双酶切连接克隆，50%的阳性率感觉有点偏低。楼主有检查过抗生素吗？有没有过期，有没有因为反复冻融而失效？
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-21 11:09:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 3/150 2026-11-10 01:40 by FChKX8meu1ds
[考博] 27博士申请 +3 白白白ly 2026-11-09 3/150 2026-11-09 21:39 by szq0819
[文学芳草园] 厉娜 +3 张丹枫1991 2026-11-09 5/250 2026-11-09 16:53 by 张丹枫1991
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 14/700 2026-11-09 11:52 by GwrQVVR6Oenx
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 16/800 2026-11-09 11:47 by GwrQVVR6Oenx
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 15/750 2026-11-09 11:41 by GwrQVVR6Oenx
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 10/500 2026-11-09 08:00 by IhnEQauGmT3K
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-09 00:14 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 23:01 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 9/450 2026-11-08 22:46 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭