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linxiaolin08

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[求助] 关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。已有4人参与

大家好，最近我在做转化后提取质粒，准备下一步进行双酶切验证后转化表达菌株BL21。但是现在遇到了问题：
目的基因与载体双酶切后连接转化（大肠杆菌28a），涂板后长菌了，我也进行挑菌PCR验证，大概挑了40多个但是只有20多个是阳性的，之后再摇菌准备提取连接后的质粒。第一次摇菌没有摇起来（使用的是挑菌做PCR验证的菌液，可能菌的密度比较小），第二次加大了接菌量（大概有150微升菌液），可是提了两次都没有成功，都是没有我想要的那么大的质粒条带，最上面有一条带，我拿去问老师老师说这是基因组DNA，不是质粒，但是我现在不知道是哪里出了问题。难道是我的菌液污染了？可是摇菌后闻起来就是大肠杆菌的味道，只是摇菌后的菌量相比正常28a摇起来量少。我确定步骤也没问题，因为我们相同时间一起做的用的同样的步骤正常的28a质粒就可以提出来。还有就是我发现一个现象，我用的是碱法抽提，第一步需要离心，离心后的沉淀不是白色，有点儿发粉色的那种，这是为什么呢?除了颜色有问题，其他的后续步骤跟正常一样没有发现有什么差别，再就是最后一步了，沉淀超级少，少到我用5微升DD水溶后浓度还非常低。很苦恼啊，各位大神帮帮我~~~如果是染菌了我需要重新涂板然后挑菌进行PCR验证么？还是说需要重新进行双酶切后连接转化？

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1楼2014-10-16 08:33:27

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linxiaolin08

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引用回帖:

4楼: Originally posted by 海之草 at 2014-10-21 11:09:50
不知楼主的插入片段有多大，连接体系是不是比例有问题？对于双酶切连接克隆，50%的阳性率感觉有点偏低。楼主有检查过抗生素吗？有没有过期，有没有因为反复冻融而失效？

你好，我的目的基因是1119bp，连接体系应该是没问题的，我们实验室用的都是25微升的体系。我做了四个对照：
A拿双酶切的质粒产物进行转化，可以证明我的质粒是否被切开，我确定我的酶切酶是好使的（我的酶切位点是EcoRI和XhoI，我之前进行过单酶切验证），结果是长了24个菌落。
B用酶切过的未进行连接反应的双酶切产物进行转化，在这一步中可以证明是否有未被酶切的原始质粒，结果是没有长菌落。
C还以原始质粒为对照，可以检测试验过程中是否有操作问题，结果为长了很多菌落。
D用无抗性平板涂感受态细胞，证明我的感受态细胞没问题。结果是长了菌落的，说明感受态没问题。
最后就是我自己的连接产物，平板上长菌落了，而且很多，没问题，挑菌进行PCR后挑选有条带的进行提取质粒后双酶切，可是结果都显示的是没连上。
我自己分析的原因：1、基因没有加上酶切位点导致我没切开，连不上。2、我的连接酶失效了不好使。
你可以帮我分析一下还有什么原因么？我已经在这呆了很久了...没办法进行下一步...谢谢。感恩！！！