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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 质粒测序后blast结果分析（菜鸟求助）
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人于两点

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒测序后blast结果分析（菜鸟求助） 已有6人参与

第一次做，质粒昨天送过去测序，今天出结果。F引物测出来一段序列1129bp，R引物测出来一段序列1154bp，可是我目的序列是1290bp啊！NCBI Blast比对结果如下：
F引物结果质粒测序后blast结果分析（菜鸟求助）
R引物结果质粒测序后blast结果分析（菜鸟求助）-1
求大神解释一下
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1楼 2014-08-06 16:02:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
人于两点: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-08-08 11:15:48
引用回帖:
12楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-07 15:28:53
恩恩，找到原因了。那大神能解释一下，引物设计时保护碱基的作用吗？谢啦！...

首先咱也是菜鸟一个，这里有点资料，希望对你有帮助，共同学习吧。
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
下表列举了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。表中的：(-) 为不能切断；(±) 为不能完全切断；(+) 为能完全切断。
结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。
Enzyme Base Pairs from Terminus
0 1 2 3
Apa I － － ± +
BamH I － ± + +
BstX I － ± + +
Cla I － ± + +
EcoR I － ± + +
EcoR V － + + +
Hind III － － － +
Not I － － + +
Pst I － － ± +
Sac I － ± + +
Sal I + + + +
Sma I － ± + +
Spe I + + + +
Xba I － ± + +
Xho I － － ± +
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14楼2014-08-07 16:57:02
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普通回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人于两点: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-06 17:40:58
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-07 10:56:02
大哥 第一次测序吧 这个很正常 测序是从模板一端开始顺着引物往下走 一般可靠的结果是800bp左右 不过测出来的结果不止800bp还要延伸一段 上下游都如此，这样上下游测出来的中间一段是重复的，你目的片段1300，测一个反应是测不完，故你上下游引物测很正确，测完拼接一下就行，不知道你明白不？
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2楼2014-08-06 16:32:53
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-06 19:41:13
需要将两段序列进行拼接。可以去测序公司主页下载相关软件，或者直接让公司帮你拼接。
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www------sr-------------
3楼2014-08-06 16:38:39
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人于两点

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-06 16:32:53
大哥 第一次测序吧 这个很正常 测序是从模板一端开始顺着引物往下走 一般可靠的结果是800bp左右 不过测出来的结果不止800bp还要延伸一段 上下游都如此，这样上下游测出来的中间一段是重复的，你目的片段1300，测一个 ...

是啊，第一次测。那大神，你是怎么拼接的呢？
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4楼2014-08-06 17:09:46
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人于两点

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-06 16:32:53
大哥 第一次测序吧 这个很正常 测序是从模板一端开始顺着引物往下走 一般可靠的结果是800bp左右 不过测出来的结果不止800bp还要延伸一段 上下游都如此，这样上下游测出来的中间一段是重复的，你目的片段1300，测一个 ...

现在拼接结果测序公司发过来了，但是拼接结果是拼接片段是1348bp，而且blast结果是质粒测序后blast结果分析（菜鸟求助）-2
为什么不是接近100%呢？而且测序的片段与目的片段只有中间是配对的（见下图）
质粒测序后blast结果分析（菜鸟求助）-3
这是为什么啊？
求大神解答啊！
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5楼2014-08-06 17:57:41
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人于两点

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-06 17:57:41
现在拼接结果测序公司发过来了，但是拼接结果是拼接片段是1348bp，而且blast结果是
为什么不是接近100%呢？而且测序的片段与目的片段只有中间是配对的（见下图）

这是为什么啊？
求大神解答啊！...

我说的接近100%是指Query cover
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6楼2014-08-06 17:59:22
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-06 17:09:46
是啊，第一次测。那大神，你是怎么拼接的呢？...

我有专门的软件 拼的话很好拼 你让测序公司给你拼好了 他们都给拼的 拼好发你一个文本
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7楼2014-08-07 08:41:20
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
人于两点(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-10 20:03:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-06 17:57:41
现在拼接结果测序公司发过来了，但是拼接结果是拼接片段是1348bp，而且blast结果是
为什么不是接近100%呢？而且测序的片段与目的片段只有中间是配对的（见下图）

这是为什么啊？
求大神解答啊！...

你这个测序，每次测不一定完全正确 有可能会发生个别碱基突变 但只要氨基酸不突变即可 你把拼好的与原始基因序列比对一下，只要测出来的是你的目的基因序列即可 两边的还有载体序列啊 没事的
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8楼2014-08-07 08:45:50
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看下面序列对比的图才知道哪里不一样，800 bp以后的测序结果不太准。
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9楼2014-08-07 09:14:26
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zhuangkai520

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
人于两点(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-10 20:03:50
拼接结果上，你可以先把你的上下游引物找到，虽然不好找，但还是能找到的，你就能知道你的片段了
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深圳的东北人
10楼2014-08-07 09:50:57
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