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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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人于两点

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒测序后blast结果分析(菜鸟求助) 已有6人参与

第一次做,质粒昨天送过去测序,今天出结果。F引物测出来一段序列1129bp,R引物测出来一段序列1154bp,可是我目的序列是1290bp啊!NCBI Blast比对结果如下:
F引物结果质粒测序后blast结果分析(菜鸟求助)
R引物结果质粒测序后blast结果分析(菜鸟求助)-1
求大神解释一下
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
人于两点: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-08-08 11:15:48
引用回帖:
12楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-07 15:28:53
恩恩,找到原因了。那大神能解释一下,引物设计时保护碱基的作用吗?谢啦!...

首先咱也是菜鸟一个,这里有点资料,希望对你有帮助,共同学习吧。
克隆PCR产物的方法之一,是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点,经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明,大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基,才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
下表列举了15种限制酶,分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。表中的:(-) 为不能切断;(±) 为不能完全切断;(+) 为能完全切断。
结果显示,基本上所有限制酶,在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后,可以对其酶切位点进行有效切断。
Enzyme Base Pairs from Terminus
0 1 2 3
Apa I - - ± +
BamH I - ± + +
BstX I - ± + +
Cla I - ± + +
EcoR I - ± + +
EcoR V - + + +
Hind III - - - +
Not I - - + +
Pst I - - ± +
Sac I - ± + +
Sal I + + + +
Sma I - ± + +
Spe I + + + +
Xba I - ± + +
Xho I - - ± +
14楼2014-08-07 16:57:02
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普通回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
人于两点: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-06 17:40:58
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-08-07 10:56:02
大哥 第一次测序吧 这个很正常 测序是从模板一端开始顺着引物往下走 一般可靠的结果是800bp左右 不过测出来的结果不止800bp还要延伸一段 上下游都如此,这样上下游测出来的中间一段是重复的,你目的片段1300,测一个反应是测不完,故你上下游引物测很正确,测完拼接一下就行,不知道你明白不?
2楼2014-08-06 16:32:53
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-06 19:41:13
需要将两段序列进行拼接。可以去测序公司主页下载相关软件,或者直接让公司帮你拼接。
www------sr-------------
3楼2014-08-06 16:38:39
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人于两点

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-06 16:32:53
大哥 第一次测序吧 这个很正常 测序是从模板一端开始顺着引物往下走 一般可靠的结果是800bp左右 不过测出来的结果不止800bp还要延伸一段 上下游都如此,这样上下游测出来的中间一段是重复的,你目的片段1300,测一个 ...

是啊,第一次测。那大神,你是怎么拼接的呢?
4楼2014-08-06 17:09:46
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人于两点

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-06 16:32:53
大哥 第一次测序吧 这个很正常 测序是从模板一端开始顺着引物往下走 一般可靠的结果是800bp左右 不过测出来的结果不止800bp还要延伸一段 上下游都如此,这样上下游测出来的中间一段是重复的,你目的片段1300,测一个 ...

现在拼接结果测序公司发过来了,但是拼接结果是拼接片段是1348bp,而且blast结果是质粒测序后blast结果分析(菜鸟求助)-2
为什么不是接近100%呢?而且测序的片段与目的片段只有中间是配对的(见下图)
质粒测序后blast结果分析(菜鸟求助)-3
这是为什么啊?
求大神解答啊!
5楼2014-08-06 17:57:41
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人于两点

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-06 17:57:41
现在拼接结果测序公司发过来了,但是拼接结果是拼接片段是1348bp,而且blast结果是
为什么不是接近100%呢?而且测序的片段与目的片段只有中间是配对的(见下图)

这是为什么啊?
求大神解答啊!...

我说的接近100%是指Query cover
6楼2014-08-06 17:59:22
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-06 17:09:46
是啊,第一次测。那大神,你是怎么拼接的呢?...

我有专门的软件 拼的话很好拼 你让测序公司给你拼好了 他们都给拼的 拼好发你一个文本
7楼2014-08-07 08:41:20
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


人于两点(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-10 20:03:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-06 17:57:41
现在拼接结果测序公司发过来了,但是拼接结果是拼接片段是1348bp,而且blast结果是
为什么不是接近100%呢?而且测序的片段与目的片段只有中间是配对的(见下图)

这是为什么啊?
求大神解答啊!...

你这个测序,每次测不一定完全正确 有可能会发生个别碱基突变 但只要氨基酸不突变即可 你把拼好的与原始基因序列比对一下,只要测出来的是你的目的基因序列即可 两边的还有载体序列啊 没事的
8楼2014-08-07 08:45:50
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

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看下面序列对比的图才知道哪里不一样,800 bp以后的测序结果不太准。
9楼2014-08-07 09:14:26
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zhuangkai520

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
人于两点(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-10 20:03:50
拼接结果上,你可以先把你的上下游引物找到,虽然不好找,但还是能找到的,你就能知道你的片段了
深圳的东北人
10楼2014-08-07 09:50:57
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