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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 质粒测序后blast结果分析（菜鸟求助）
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杨仔

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是对的，两边对不上的是载体的MCS，中间完全匹配的是你的目的基因。
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11楼2014-08-07 14:45:18
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人于两点

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-07 08:45:50
你这个测序，每次测不一定完全正确 有可能会发生个别碱基突变 但只要氨基酸不突变即可 你把拼好的与原始基因序列比对一下，只要测出来的是你的目的基因序列即可 两边的还有载体序列啊 没事的...

恩恩，找到原因了。那大神能解释一下，引物设计时保护碱基的作用吗？谢啦！
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12楼2014-08-07 15:28:53
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人于两点: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-07 15:47:30
拼接方法：首先下游引物测序结果反向互补，和上游引物测序结果比对，这个你会吧，各种软件还有NCBI都可以。
比对结果会有中间一段是重复的，因为从基因的两头测，都测了1K多，而你的基因才1K多，肯定会重复的。然后把下游引物测序结果重复下面的序列和上游的序列拼接到一块儿。最后在这条新的序列上找到你的上下游引物，也就找到了你的目的基因。下面的说一下分析，找到以后再和你的真正目的基因序列比对，看看测序结果有没有问题，如果有问题，再去看测序的峰图是否有问题。如果比对没问题，ok，测序是正确的。
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13楼2014-08-07 15:39:15
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
人于两点: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-08-08 11:15:48
引用回帖:
12楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-08-07 15:28:53
恩恩，找到原因了。那大神能解释一下，引物设计时保护碱基的作用吗？谢啦！...

首先咱也是菜鸟一个，这里有点资料，希望对你有帮助，共同学习吧。
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
下表列举了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。表中的：(-) 为不能切断；(±) 为不能完全切断；(+) 为能完全切断。
结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。
Enzyme Base Pairs from Terminus
0 1 2 3
Apa I － － ± +
BamH I － ± + +
BstX I － ± + +
Cla I － ± + +
EcoR I － ± + +
EcoR V － + + +
Hind III － － － +
Not I － － + +
Pst I － － ± +
Sac I － ± + +
Sal I + + + +
Sma I － ± + +
Spe I + + + +
Xba I － ± + +
Xho I － － ± +
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14楼2014-08-07 16:57:02
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人于两点

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-07 16:57:02
首先咱也是菜鸟一个，这里有点资料，希望对你有帮助，共同学习吧。
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位 ...

谦虚了，大神。
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15楼2014-08-08 11:17:34
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小佳佳佳佳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-07 16:57:02
首先咱也是菜鸟一个，这里有点资料，希望对你有帮助，共同学习吧。
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位 ...

测序结果怎么统计呢。我们做表格统计来源时是把所有列出来的来源都写上去吗？还是自己随意挑选一个
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16楼2014-12-10 16:44:16
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