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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 测序结果与NCBI有差别，求解释！
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)

夜未眠

[求助] 测序结果与NCBI有差别，求解释！已有2人参与

测序结果与NCBI有差别，求解释！

我现在P的是RNA的CDS序列，我引物设计正好是全长CDS，过程是先提RNA再反转cDNA，以cDNA为模板进行PCR，P出来后，胶回收，19T连接，转染，测序。
现在的问题是：NCBI上这段CDS序列长度为2019bp，可是测序结果却是2116BP，多了将近100bp，两端我也进行了Blast比对，结果相似度99%。我现在不知道这是为什么？
我直接让测序公司拼接的，多的序列在测序结果的93-183，另外在其他部位还有多1-2个碱基的现象，只有几处，但是93-183这段不知道是什么？
求高人解释

[ Last edited by 小木虫刘树青 on 2014-1-27 at 19:58 ]
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世界上只有一种真正的英雄主义，那就是看清生活的真相之后，依然热爱生活。
1楼2014-01-27 18:39:11
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wizardfan

至尊木虫 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小木虫刘树青: 金币+2 2014-01-28 16:26:46
youlinglyw: 金币+2 2014-07-19 09:20:57
可能是蛋白的isoform，很正常。可以比下蛋白序列
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2楼2014-01-28 03:22:54
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)

夜未眠
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2014-01-28 11:29:33
引用回帖:
2楼: Originally posted by wizardfan at 2014-01-28 03:22:54
可能是蛋白的isoform，很正常。可以比下蛋白序列

蛋白的isoform是？请问怎么比对蛋白质序列啊？我用premer5里面核酸序列转换成蛋白质氨基酸的功能，比对后与NCbi上的CDS核酸序列翻译的蛋白质氨基酸只有30%相似，我是不是比错了，我是不是只用相似的核酸序列比对啊，也就是93-183以外的那些核酸序列翻译成的蛋白氨基酸与NCBI上的CDS翻译的蛋白质氨基酸比对啊？
我挑了8个，做了菌液PCR，只有三个P出目的条带，所以测序的是三个，这三个都是一样的，我直接让测序公司拼接的，多的序列在测序结果的93-183，另外在其他部位还有多1-2个碱基的现象，只有几处，但是93-183这段不知道是什么？
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世界上只有一种真正的英雄主义，那就是看清生活的真相之后，依然热爱生活。
3楼2014-01-28 09:49:03
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小木虫刘树青: 金币+3, ★有帮助 2014-01-28 16:26:32
youlinglyw: 金币+2 2014-07-19 09:21:14
看一下是否是第一内含子序列，也就是确认一下该基因是否存在可变剪接的可能。
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总有一天我要修改用户名。
4楼2014-01-28 11:30:29
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)

夜未眠
引用回帖:
4楼: Originally posted by 137167741 at 2014-01-28 11:30:29
看一下是否是第一内含子序列，也就是确认一下该基因是否存在可变剪接的可能。

基因有可变剪接是什么啊？我是以RNA为模板反转录cDNA的，应该不会有内含子序列吧？
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5楼2014-01-28 11:49:41
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小木虫刘树青 at 2014-01-28 11:49:41
基因有可变剪接是什么啊？我是以RNA为模板反转录cDNA的，应该不会有内含子序列吧？...

当存在可变剪接的时候，所谓的内含子就不再是内含子了。什么是可变剪接，你可以查一下看看。
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总有一天我要修改用户名。
6楼2014-01-28 12:41:34
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)

夜未眠
引用回帖:
6楼: Originally posted by 137167741 at 2014-01-28 12:41:34
当存在可变剪接的时候，所谓的内含子就不再是内含子了。什么是可变剪接，你可以查一下看看。...

你好！我现在研究的这个基因，是转录因子，在NCBI里mRNA and Protein有17种变型（transcript variant），我设计引物是只用的其中一个的mRNA的CDS序列设计的。我刚才有比对了全部的17个，有几个测序序列的93-183是可以对应上的。
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世界上只有一种真正的英雄主义，那就是看清生活的真相之后，依然热爱生活。
7楼2014-01-28 12:43:45
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biology-girl

新虫 (正式写手)
请问楼主有解决吗？ 最近偶遇到了同样的问题。
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8楼2014-07-19 08:57:51
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