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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序结果出现单碱基的重叠峰
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)

[求助] 测序结果出现单碱基的重叠峰 已有1人参与

大家好啊！
我先设计了一对引物，分别对雌雄进行扩增，得到扩增片段进行测序，测序的结果序列都是一样的，但是有个小问题，为什么其中一个碱基出现了重叠峰，其它碱基都没有，不知道什么原因，又代表着什么意思？我这两个序列都是克隆测序的，之前在另外一个扩增中也得出了相同的重叠峰
希望了解的高手们能给出答案啊！
实验好急···
测序结果出现单碱基的重叠峰
H4X，H4C比对.jpg
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1楼 2013-06-13 16:18:28
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yhbletter

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励发帖解答问题。 2013-06-13 18:43:36
有这样一种情况
当某一个基因来源于父本和母本，即这个基因在基因组中有2个拷贝，而两个拷贝之间有单碱基的不同，而你PCR时同时克隆出了两个拷贝，那么测序的时候就有可能是你测序的那种结果。
你可以看一下那个碱基的突变是否影响氨基酸。
你可以将你测序的结果和NCBI上的结果比对一下，看一下那个位置是否有SNP。如果有那就是正常的了，如果没有，建议重复一次，或者克隆到载体中，多挑几个克隆测序
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2楼2013-06-13 17:16:27
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-06-13 17:16:27
有这样一种情况
当某一个基因来源于父本和母本，即这个基因在基因组中有2个拷贝，而两个拷贝之间有单碱基的不同，而你PCR时同时克隆出了两个拷贝，那么测序的时候就有可能是你测序的那种结果。
你可以看一下那个碱 ...

嗯，感觉应该就是你说的这种情况，但是SNP可能查不出来，这是一种植物，还没人研究过，我是在做分子标记鉴定雌雄的时候，得到了这个重叠峰。因为信息很少，序列也就500bp左右，也不知道哪些是编码氨基酸的
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3楼2013-06-13 21:54:51
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-15 21:36:47
你测序如果是单克隆测序应该不会出现这样的情况，测序也需要扩增，也许引入了突变。但是你以前的测序也出现了同样的结果，我想可能就是你的单克隆并非单克隆，从峰图上看这是很明显的杂合体，测序结果底峰有点高！建议多挑几个单克隆测序，并用你的PCR产物同时做双向测序！预计结果是PCR产物有同样的套峰，而克隆没有套峰且这个点的碱基有两种！
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低调稳重务实内敛---------------残
4楼2013-06-14 09:06:03
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wu_shiyong at 2013-06-14 09:06:03
你测序如果是单克隆测序应该不会出现这样的情况，测序也需要扩增，也许引入了突变。但是你以前的测序也出现了同样的结果，我想可能就是你的单克隆并非单克隆，从峰图上看这是很明显的杂合体，测序结果底峰有点高！建 ...

也就是说，其实这个点就是有两种碱基，但是我的单克隆不准确。非常谢谢您的回答，我已经叫公司重新做下克隆测序，然后再看看结果。
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5楼2013-06-14 14:38:39
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BiologyDYJLU

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

请问在测序反应中某个碱基出现套峰，是否说明该等位基因是杂合子呢？         
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请问在测序反应中某个碱基出现套峰，是否说明该等位基因是杂合子呢？
套峰？我只知道那代表测序没测好吧。你测了几次？每次都一样吗。什么是杂合子。你拿什么去测的
在特定一个碱基上，测了三次，每次都有套峰。杂合子就是说等位基因在这个碱基的位置上是存在SNP的，所以会产生套峰。是不是这样呢？
如果只在某个碱基处有套峰，其他地方都没有杂峰，那基本上就是杂合的。用反向引物再测一次，结果更准确。
那请问你是送的啥去测序？
常用的方法1：pcr产物纯化->回收连质粒->转化摇菌->平板挑单克隆->单克隆培养并PCR验证->送菌液；
方法2：PCR产物纯化->回收测浓度->送测序。
方法1的话，即便是杂合子也测不出来套峰……方法2的话，倒是有可能出套峰。
这个位置前后都一致么？是否双向测序呢？位置附近的峰图正常好看不？最好贴一下。

测序出现重叠峰是怎么回事？
我是用PCR产物直接测序的，电泳图上条带很清楚也没有拖尾巴，会出现杂带吗？还有我的产物里是含染料的会有影响吗？
周_yan (站内联系TA)
我认为应该不是你说的这方面原因，而是测序时的问题，测序一个反应只能准确测700bp左右，超过这些就会测不准，出现重叠峰。当然也有可能是你pcr产物的问题。
ztjren (站内联系TA)
我的产物是1.9K，送去上海生工测的，好像网上对生工测序反应不太好，请教各位可有什么好的推荐，TAKARA测序如何？
周_yan (站内联系TA)
上海博尚测序不错。
bunny0512 (站内联系TA)
我在北京。。用华大基因
wangxueqin (站内联系TA)
PCR产物的问题，可能目的片段不纯，有杂事，或者是目的片段里面有AAAAAAAAAAAAAAAAAA之类的，也会造成出现杂峰
won7 (站内联系TA)
如果在600bp以内，峰比较尖但出现重叠峰，基本可以肯定是产物杂合，如二倍体或多倍体的核目的基因是杂合的。
ztjren (站内联系TA)
我送样的时候注明了是未纯化的PCR产物，难道生工直接拿来测序了么？
怎么都行 (站内联系TA)
Originally posted by ztjren at 2010-08-25 11:56:34:
我送样的时候注明了是未纯化的PCR产物，难道生工直接拿来测序了么？
对你这个问题而言产物杂合跟纯不纯化没关系。如上楼所说，你如果是扩增多倍体的某段基因序列，在某个碱基座位上本来就存在等位基因的差异或SNP，那你扩增得到的PCR产物虽然长度相同，但其实是杂和产物，产物分子的碱基序列不是统一的，你用PCR产物直接测序，在等位基因有差异或SNP位点上必然是套峰。这种情况你该克隆挑单菌落测序了。
ztjren (站内联系TA)
原来是这个意思，学习了，请教若真是多倍体的话等位基因上的差异怎么通过克隆来区分开来呢，还有即便测出序列了又如何能代表该多倍体的基因，不会用多条序列来表示吧？我不太懂可能问的比较幼稚，请大家赐教。
我扩增的是肝吸虫的18S
怎么都行 (站内联系TA)
rRNA基因保守性很强，按说同一个物种的rDNA不该有差别，否则就变成另一个种群了。看来你的套峰还真有可能是测序本身的问题，套峰出现在什么位置，在测序结果的首尾还是中间？
ztjren (站内联系TA)
没具体说重叠峰在什么位置，回邮件说再加大量测，结果又说没信号
amilie030312 (站内联系TA)
很可能是有条带大小比较接近的非特异扩增了，或者一些非特异扩增的量还比较小在琼脂糖胶上没看出来。尤其是片段已经达到了1.9个KP，这么长肯定是有问题的啦，建议你做克隆后再送测序，如果实在做不了克隆那就做一下二次PCR，看有没有杂带，然后再跑一下垂直板看看有没有杂带，如果都没有那生工还测不出来那就让他们直接能滚多远就滚多远吧，Takara的测序也那样，没和生工有啥差别，现在Takara已经是国产试剂了，都是大连产的啦。
ztjren (站内联系TA)
如此看来产生重叠峰的原因有可能是非特异性扩增产生的杂带，或者片段太长自身碱基互补造成的吗，
若杂带量小到电泳都看不出来，应该不至于影响到测序吧，如果是条带大小比较接近的非特异扩增如何能通过克隆来区分呢，非目的基因不也会一起克隆进去么？
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6楼2014-05-30 16:17:06
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BiologyDYJLU

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-06-13 17:16:27
有这样一种情况
当某一个基因来源于父本和母本，即这个基因在基因组中有2个拷贝，而两个拷贝之间有单碱基的不同，而你PCR时同时克隆出了两个拷贝，那么测序的时候就有可能是你测序的那种结果。
你可以看一下那个碱 ...

你好，我也有类似结构，单碱基重叠，测序有100个个体，其中有10几个这样的情况，这是不是说明有杂合？或是2个拷贝？如何进行”看一下那个位置是否有SNP“？非常感谢
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7楼2014-05-30 16:34:23
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