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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序结果出现单碱基的重叠峰
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)

[求助] 测序结果出现单碱基的重叠峰 已有1人参与

大家好啊！
我先设计了一对引物，分别对雌雄进行扩增，得到扩增片段进行测序，测序的结果序列都是一样的，但是有个小问题，为什么其中一个碱基出现了重叠峰，其它碱基都没有，不知道什么原因，又代表着什么意思？我这两个序列都是克隆测序的，之前在另外一个扩增中也得出了相同的重叠峰
希望了解的高手们能给出答案啊！
实验好急···
测序结果出现单碱基的重叠峰
H4X，H4C比对.jpg
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1楼 2013-06-13 16:18:28
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-15 21:36:47
你测序如果是单克隆测序应该不会出现这样的情况，测序也需要扩增，也许引入了突变。但是你以前的测序也出现了同样的结果，我想可能就是你的单克隆并非单克隆，从峰图上看这是很明显的杂合体，测序结果底峰有点高！建议多挑几个单克隆测序，并用你的PCR产物同时做双向测序！预计结果是PCR产物有同样的套峰，而克隆没有套峰且这个点的碱基有两种！
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低调稳重务实内敛---------------残
4楼2013-06-14 09:06:03
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yhbletter

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励发帖解答问题。 2013-06-13 18:43:36
有这样一种情况
当某一个基因来源于父本和母本，即这个基因在基因组中有2个拷贝，而两个拷贝之间有单碱基的不同，而你PCR时同时克隆出了两个拷贝，那么测序的时候就有可能是你测序的那种结果。
你可以看一下那个碱基的突变是否影响氨基酸。
你可以将你测序的结果和NCBI上的结果比对一下，看一下那个位置是否有SNP。如果有那就是正常的了，如果没有，建议重复一次，或者克隆到载体中，多挑几个克隆测序
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2楼2013-06-13 17:16:27
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-06-13 17:16:27
有这样一种情况
当某一个基因来源于父本和母本，即这个基因在基因组中有2个拷贝，而两个拷贝之间有单碱基的不同，而你PCR时同时克隆出了两个拷贝，那么测序的时候就有可能是你测序的那种结果。
你可以看一下那个碱 ...

嗯，感觉应该就是你说的这种情况，但是SNP可能查不出来，这是一种植物，还没人研究过，我是在做分子标记鉴定雌雄的时候，得到了这个重叠峰。因为信息很少，序列也就500bp左右，也不知道哪些是编码氨基酸的
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3楼2013-06-13 21:54:51
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wu_shiyong at 2013-06-14 09:06:03
你测序如果是单克隆测序应该不会出现这样的情况，测序也需要扩增，也许引入了突变。但是你以前的测序也出现了同样的结果，我想可能就是你的单克隆并非单克隆，从峰图上看这是很明显的杂合体，测序结果底峰有点高！建 ...

也就是说，其实这个点就是有两种碱基，但是我的单克隆不准确。非常谢谢您的回答，我已经叫公司重新做下克隆测序，然后再看看结果。
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5楼2013-06-14 14:38:39
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