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汕头大学海洋科学接受调剂
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)

[求助] 测序结果出现单碱基的重叠峰 已有1人参与

大家好啊!
我先设计了一对引物,分别对雌雄进行扩增,得到扩增片段进行测序,测序的结果序列都是一样的,但是有个小问题,为什么其中一个碱基出现了重叠峰,其它碱基都没有,不知道什么原因,又代表着什么意思?我这两个序列都是克隆测序的,之前在另外一个扩增中也得出了相同的重叠峰
希望了解的高手们能给出答案啊!
实验好急···
测序结果出现单碱基的重叠峰
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-06-13 17:16:27
有这样一种情况
当某一个基因来源于父本和母本,即这个基因在基因组中有2个拷贝,而两个拷贝之间有单碱基的不同,而你PCR时同时克隆出了两个拷贝,那么测序的时候就有可能是你测序的那种结果。
你可以看一下那个碱 ...

嗯,感觉应该就是你说的这种情况,但是SNP可能查不出来,这是一种植物,还没人研究过,我是在做分子标记鉴定雌雄的时候,得到了这个重叠峰。因为信息很少,序列也就500bp左右,也不知道哪些是编码氨基酸的
3楼2013-06-13 21:54:51
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yhbletter

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励发帖解答问题。 2013-06-13 18:43:36
有这样一种情况
当某一个基因来源于父本和母本,即这个基因在基因组中有2个拷贝,而两个拷贝之间有单碱基的不同,而你PCR时同时克隆出了两个拷贝,那么测序的时候就有可能是你测序的那种结果。
你可以看一下那个碱基的突变是否影响氨基酸。
你可以将你测序的结果和NCBI上的结果比对一下,看一下那个位置是否有SNP。如果有那就是正常的了,如果没有,建议重复一次,或者克隆到载体中,多挑几个克隆测序
2楼2013-06-13 17:16:27
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-15 21:36:47
你测序如果是单克隆测序应该不会出现这样的情况,测序也需要扩增,也许引入了突变。但是你以前的测序也出现了同样的结果,我想可能就是你的单克隆并非单克隆,从峰图上看这是很明显的杂合体,测序结果底峰有点高!建议多挑几个单克隆测序,并用你的PCR产物同时做双向测序!预计结果是PCR产物有同样的套峰,而克隆没有套峰且这个点的碱基有两种!
低调稳重务实内敛---------------残
4楼2013-06-14 09:06:03
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追风舞尘

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wu_shiyong at 2013-06-14 09:06:03
你测序如果是单克隆测序应该不会出现这样的情况,测序也需要扩增,也许引入了突变。但是你以前的测序也出现了同样的结果,我想可能就是你的单克隆并非单克隆,从峰图上看这是很明显的杂合体,测序结果底峰有点高!建 ...

也就是说,其实这个点就是有两种碱基,但是我的单克隆不准确。非常谢谢您的回答,我已经叫公司重新做下克隆测序,然后再看看结果。
5楼2013-06-14 14:38:39
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