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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒ＤＮＡ双酶切，怎么切不开
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韩元富豪

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒ＤＮＡ双酶切，怎么切不开 已有1人参与

　最近把好不容易PCR扩增出了目的条带，连接Ｔ载体（T 载体是T-Easy vector ），转化，菌落ＰＣＲ、提质粒DNA都有条带，在双酶切时，却怎么也切不开，用的酶是Thermo Scientific 的快切酶，Kpn I 和Hind III,反应体系是30ul ,因为提质粒时载体，条带有点暗，
        所以双酶切体系是：质粒:    6ul;
                                   Kpn I:   1.5ul;
                                  Hind III:  1.5ul
                                   buffer:   3ul;
                                   dd H2O: 18ul;
            同时分别用Kpn I 和Hind III 单酶切，反应温度37℃，3个半小时，跑电泳，双酶切，双酶切和原质粒走在同一位置，说明没有切开，改变反应时间5h， 跑电泳就没有条带了，这是怎么回事，很着急，试验又进展不下去了
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1楼 2014-06-25 20:30:11
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
韩元富豪: 金币+2 2014-06-30 17:53:57
你用的哪个公司的T-easy 载体，是promega的吗？pGEM T-easy

KpnI和HindIII是载体上的酶切位点吗？还是你设计引物自带的酶切位点
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-06-25 20:33:39
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