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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 酶切片段都切碎了，什么原因
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heihei2866

铁虫 (正式写手)

[求助] 酶切片段都切碎了，什么原因 已有1人参与

本人最近在做PCR产物双酶切，本来PCR产物大小在1300 bp，测序验证正确，然后用salI和sphI双酶切后片段只有100bp了，条带非常亮，怀疑是酶切问题，分别用两个酶单酶切，时间也相应缩短，但是结果仍一样；换用了EcoRI和HindIII分别进行单酶切，结果仍一样，这是什么原因啊？之前实在没有碰到过，请各位高手指点一下！
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1楼 2014-06-19 10:49:27
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么情况？你克隆到载体上切下来的吗？

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2楼2014-06-19 11:04:36
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
heihei2866: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-23 12:29:33
你确定基因内部没有所用的酶的酶切位点吗？

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3楼2014-06-19 11:05:16
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heihei2866

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 11:04:36
什么情况？你克隆到载体上切下来的吗？

不是，我是用高保真的酶扩增的，PCR产物纯化后直接做酶切
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4楼2014-06-19 11:23:44
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heihei2866

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 11:05:16
你确定基因内部没有所用的酶的酶切位点吗？

没有，这个序列测序了，确定没有这些酶切位点
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5楼2014-06-19 11:24:23
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by heihei2866 at 2014-06-19 11:24:23
没有，这个序列测序了，确定没有这些酶切位点...

你不会说的是基因组测序分析的结果吧？那个不一定准的。PCR产物酶切结果发个图过来

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6楼2014-06-19 12:01:19
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heihei2866

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 12:01:19
你不会说的是基因组测序分析的结果吧？那个不一定准的。PCR产物酶切结果发个图过来
...

不是基因组测序结果，是PCR产物纯化后测序的结果，证明没有酶切位点，唉，酶切前后的电泳图如附图所示，我感觉是PCR产物被切碎了，只是找不到原因
酶切片段都切碎了，什么原因
酶切.png
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7楼2014-06-19 16:27:18
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
heihei2866(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:43:48
引用回帖:
7楼: Originally posted by heihei2866 at 2014-06-19 16:27:18
不是基因组测序结果，是PCR产物纯化后测序的结果，证明没有酶切位点，唉，酶切前后的电泳图如附图所示，我感觉是PCR产物被切碎了，只是找不到原因

酶切.png
...

你这样太折腾啦，直接克隆到t载体，测序对了，将片段从t载体上切下来，稳妥点，你测了序列，又要这个基因，策略选的不好哦。

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8楼2014-06-19 16:31:27
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heihei2866

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 16:31:27
你这样太折腾啦，直接克隆到t载体，测序对了，将片段从t载体上切下来，稳妥点，你测了序列，又要这个基因，策略选的不好哦。
...

呵呵，因为当时没有T-blunt载体，所以想直接酶切PCR产物做连接，我们之前这样做都没有问题的，就是现在出现这种奇怪的现象
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9楼2014-06-19 16:39:54
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
heihei2866(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:44:00
引用回帖:
9楼: Originally posted by heihei2866 at 2014-06-19 16:39:54
呵呵，因为当时没有T-blunt载体，所以想直接酶切PCR产物做连接，我们之前这样做都没有问题的，就是现在出现这种奇怪的现象...

可以用taq加a或者直接用taq扩，平末端的载体有点小贵，平末端克隆没ta好做哦

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10楼2014-06-19 16:45:54
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